FSHW | 氯虫苯甲酰胺暴露通过调控肠道菌群及其代谢物加剧高脂饮食诱导的小鼠代谢紊乱

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Abstract

食物污染物，特别是杀虫剂，是导致肥胖和其他不良影响的重要因素。作为世界上使用最广泛的双酰胺类杀虫剂，氯虫苯甲酰胺（CP）在食品和环境中无处不在。然而，CP对肥胖和肠道菌群的影响仍然未知。在这项研究中，通过灌胃给高脂饮食（HFD）的C57BL/6J小鼠注射CP/羧甲基纤维素钠13周。CP暴露导致体质量增加、脂肪量、血清总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）显著增加。此外，CP通过增加肥胖相关细菌的相对丰度和减少有益细菌的比较丰度，加剧了肠道菌群的不平衡。基于非靶向代谢组学分析，CP被发现参与调节包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及精氨酸和脯氨酸代代谢的途径。值得注意的是，CP暴露主要引起这些途径中微生物代谢产物的变化，如L-(+)-天冬氨酸和L-谷氨酸。此外，单个代谢物，如脂质介体（油酰乙醇酰胺），在接触CP时也表现出变化。此外，Spearman相关分析揭示了微生物改变、代谢物变化和表型之间的几个值得注意的关联。研究结果表明，微生物群、代谢产物和CP暴露对HFD诱导的肥胖的影响之间存在联系，阐明了肠道微生物群及其代谢产物在CP毒性效应中的关键作用。

Introduction

有毒有害物质，如农药，可能会渗透到食物中。这可能导致污染，降低其营养价值或对生物体造成不同程度的伤害。同时，农药和兽药可能会积累在动物产品中。随着这种复杂和多因素疾病的不断发展，全球肥胖症的发病率正在迅速增加，目前将其归因于遗传、能量摄入和消耗失衡以及来自环境污染物（如农药）的影响。农药和农药残留是日常食品消费中普遍存在的污染物。先前的研究报告了某些农药暴露与肥胖、2型糖尿病、肠道菌群失调及代谢综合征等状况之间的密切关联。然而，双酰胺类杀虫剂对肥胖发展和肠道菌群的影响仍不清楚。

双酰胺类杀虫剂因其对昆虫兰尼定受体（RyR）的选择性作用优于哺乳动物RyR，展现出高杀虫活性及对哺乳动物的显著安全性，现已成为应用最广泛的农药类别之一。氯虫苯甲酰胺（CP）作为该类杀虫剂的代表品种，被广泛用于大豆、水稻、果树、蔬菜等作物的害虫防控。先前的研究表明，在作物、土壤和牲畜的组织（如脂肪、肌肉、肝脏和肾脏组织）中检测到CP残留。研究表明，在牲畜中，CP的主要代谢途径与水稻中观察到的步骤相似：N-脱甲基化、甲基苯羟化、进一步氧化成羧酸；与水合失去环化形成喹唑啉酮衍生物；以及N-甲基酰胺水解形成苯甲酸衍生物。老鼠实验表明，长期暴露于CP（18个月）会导致肝细胞肥大和肝脏重量增加。此外，最近的一项研究表明，CP通过AMP-激活蛋白激酶α（AMPKα）途径在3T3-L1脂肪细胞中诱导脂肪生成。然而，鲜有没有关于CP暴露对肥胖或肠道菌群在体内的影响的报告。

特别值得注意的是，有一些证据表明肠道微生物群与肥胖之间存在因果关系，以及具有各种生物功能的微生物代谢物，这突显了肠道微生物群与宿主之间的相互作用。人们越来越有兴趣将不同的组学结合起来，以研究肥胖发展的潜在机制。相关研究表明，肠道菌群无意中成为农药中毒的受体，导致宿主肠道菌群失调以及代谢紊乱。

本研究的主要目的是调查CP暴露对小鼠模型肥胖发展的影响，并整合各种组学方法，以增强对高脂饮食（HFD）小鼠中CP诱导肥胖机制的理解。通过使用16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学方法，本研究旨在阐明双酰胺类杀虫剂（以CP为例）在诱导异常脂质代谢中的作用机制。通过这种方式，它寻求为探索环境污染物与动物代谢之间的复杂关系提供新的见解。此外，该研究旨在为评估食品安全风险提供理论支持。

Results

CP暴露对HFD小鼠肥胖和脂质代谢的影响

在暴露于HFD13周后，对实验组进行了几个测量，以评估其对实验组的影响。与对照组相比，M组小鼠的体质量、肝脏重量及附睾白色脂肪组织重量（e-WAT）均呈现显著升高。在L组中，虽然平均体质量和组织重量略高于对照组，但没有显著差异（图1a-b，d-e）。食物摄入量在各处理组和对照组之间没有差异（图1c，P＞0.05），这表明CP诱导的小鼠体质量增加不是由于食物摄入量变化引起的。

图1 氯虫苯甲酰胺（CP）暴露对高脂饮食小鼠肥胖和脂质代谢的影响

由于M组表现出更显著的效果，后续的实验聚焦于中剂量CP暴露的后果。CP暴露似乎在HFD小鼠中诱导了异常的脂质代谢。具体而言，CP显著增加了血清TC和LDL-C浓度（P＜0.05），而TG和HDL-C浓度在M组中没有显著变化（P＞0.05）。进一步探索CP的内在效应涉及评估肝脏脂质含量，发现肝脏TC含量显著增加（P＜0.05）。而TG含量没有显著变化（图1j-k）。对脂肪组织中脂肪细胞的显微镜检查表明，M组脂肪细胞比对照组大（图1）。综上所述，这些发现表明中剂量CP加剧了HFD诱导的肥胖。

CP对HFD小鼠肠道微生物群的影响

最近的研究强调了肠道微生物群失衡与肥胖之间的密切关系，将其确定为导致宿主肥胖的重要因素。基于这一知识，本研究采用16S rRNA测序来调查CP是否引起肠道菌群的改变。对肠道微生物群的分析显示，与对照组相比，CP暴露导致优势肠道细菌在门水平上的相对丰度发生变化，包括厚壁菌门、拟杆菌门和变形杆菌门（图2a）。此外，在属水平上，CP暴露导致特定细菌丰度的不同程度变化（图2b）。具体而言，与对照组相比，CP暴露导致优势菌群醋酸杆菌属、罗姆布茨菌属及丁酸球菌属丰度显著降低，同时显著增加狭义梭菌属和巴恩斯氏菌属的丰度（图2c-g）。α-多样性分析显示，所有实验组的覆盖度指数均超过99%，表明测序深度达到饱和状态。在β-多样性分析方面，基于加权UniFrac的箱线图表明两组之间的β-多样性具有统计学显著差异（图2h）。然而，通过主坐标分析（PCoA）可视化显示，PCoA并未明显区分两组，表明两组细菌群落组成和结构相似（图2i）。PCoA计算过程使用了迭代算法，考虑了加权物种分类丰度信息。基于所有样本中序列数最少样本的75%的序列数进行采样分析，经过100次迭代后得到最终的PCoA显示图表。这些差异表明农药处理可能影响现有微生物的生长和肠道微生物群落中相对丰度的变化。因此，这些发现表明中剂量的CP暴露可以引起肠道微生物群落中特定细菌物种丰度的变化，可能加剧HFD喂养小鼠中存在的肠道菌群失衡。

图2 氯虫苯甲酰胺（CP）对高脂饮食小鼠肠道微生物群的影响

CP对HFD小鼠粪便代谢物的影响

在暴露于CP的情况下，肠道微生物群的改变可能会影响粪便代谢物的变化。本研究利用非靶向代谢组学来探索宿主粪便代谢物的具体变化。在粪便样本中检测到5826种代谢物，其中1677种被鉴定，包括脂质、氨基酸、肽和类似物、苯和衍生物、萜类、有机酸、甾族化合物和衍生物、碳水化合物等（图3a）。随后，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）得分图显示了CP给药组和对照组之间的明显分离。置换检验证实了OPLS-DA模型的优良性，没有过度拟合（图3b）。火山图显示了差异代谢物的总体分布，识别了具有变化和统计显著性的数据点。共有228种差异代谢物显示出变化，其中92种上调，136种下调（图3c）。此外，差异代谢物聚类热图可以通过不同颜色可视化这些代谢物的表达和差异（图3d）。

图3 氯虫苯甲酰胺（CP）对高脂饮食小鼠粪便代谢物的影响

所有这些代谢物都参与丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢途径。此外，花生四烯酸代谢物，包括11-脱氢血栓素B2和6-酮前列腺素F1α，在CP暴露后显著减少。同时，内源性大麻素样化合物油酸乙醇酰胺（OEA），这是在小肠近端产生的饱腹因子，与对照组相比也显著减少。重要的是，粪便样本中检测到完整的CP，其代谢物N-（2-苯基乙基）-β-D-葡糖基尿嘧啶胺和8-羟基喹啉的水平显著高于对照组。这些结果表明，CP在体内可以部分代谢。

为了评估变化代谢物的代谢途径富集情况，使用了京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库。几个差异代谢物的富集途径包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢（图3e）。这表明这些代谢功能直接或间接地促进了CP诱导的肥胖。对实验组中前10个显著富集的代谢途径进行DA得分分析，结果显示与粪便中的差异一致。在CP处理后，差异代谢物在精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸和脯氨基酸代谢以及半胱氨酸和蛋氨基酸代谢中的表达上调，而苯丙氨酸代谢的表达下调（图3e）。

寄主表型、不同属和粪便中鉴别代谢物的相关性分析

进行Spearman相关性分析，探讨属水平肠道菌群与暴露于CP干预后粪便代谢物之间的关联。本分析揭示了由于CP暴露而导致的粪便代谢物的显着变化，这与特定的肠道微生物群密切相关。值得关注的是，狭义梭菌属的丰度与5-胍基-2-氧代戊酸、苯丙酮酸及α-酮戊二酸等代谢物呈正相关，而与熊果酸、油酰乙醇胺（OEA）等代谢物呈负相关（图4a）。对照组中丰度较高的醋酸杆菌属与11-脱氢血栓烷B2、6-酮前列腺素F1α及熊果酸呈正相关。丁酸球菌属水平与5-胍基-2-氧代戊酸、吲哚-3-丙酮酸、γ-氨基丁酸（GABA）及L-谷氨酸呈负相关，而巴恩斯氏菌属则与这些代谢物呈正相关（图4a）。此外，分析旨在确定体质量增加是否与不同的属或判别代谢物有关。本实验中的不同代谢物，涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径，与体质量增加、血清LDL-C和e-WAT呈正相关。此外，肝脏TC和体质量增加与CP代谢物呈正相关。相反，OEA与血清TC、血清LDL-C、肝脏TC和体质量增加呈负相关（图4b）。

图4 通过斯皮尔曼相关性分析，粪便差异代谢物、微生物物种和宿主表型之间的相关性

Discussion

在本研究中，CP的给药加剧了HFD诱导的小鼠肥胖，而没有改变食物摄入量。这种表现通过附睾白色脂肪细胞的增大和体质量增加的增加而明显。此外，观察到CP暴露导致HFD小鼠的肠道微生物群失调加剧，并改变了粪便代谢物，这为CP在体内促进肥胖的作用提供了新的证据。

既往研究报道，暴露于最低可观察到不良反应水平（LOAEL）剂量935 mg/（kg·d）的CP会导致小鼠肝脏重量升高，并伴有雄性小鼠嗜酸性粒细胞病变和肝细胞肥大的发展。另一项实验表明，大鼠、小鼠和狗每天服用1000 mg/kg体质量的高测试剂量后，肝脏重量持续增加，这归因于与肝脏代谢和CYP450肝酶诱导相关的药理反应。在这项研究中，暴露于CP 13周显著增加了肝脏重量。进一步的实验显示，肝TC含量增加，PPARα（一种促进脂肪分解的基因）的表达降低。在3T3-L1脂肪细胞模型中，CP已被证明通过AMPKα途径诱导TG合成和脂肪生成因子的表达，而不是通过内质网（ER）应激途径。相反，现有研究表明，另一种类烟碱类杀虫剂氟苯虫酰胺通过AMPKα介导的途径促进脂肪生成。此外，肥胖通常伴有代谢综合征和血脂异常，主要表现为高胆固醇血症和高甘油三酯血症等症状。。研究结果表明，在HFD小鼠中，暴露于CP会进一步加剧脂质代谢紊乱，表现为血清TC和LDL-C含量的显著增加。

胃肠道是接触受污染食物的主要部位，充当了最初的物理和生物屏障。因此，动物的肠道和肠道微生物群可能直接或间接受到农药毒性的影响。这项研究表明，尽管肠道微生物群的总体结构在CP暴露后没有显著变化，但某些属的丰度发生了显著变化。具体而言，醋酸杆菌属、隆堡氏菌属和丁酸球菌属的丰度降低，而狭义梭菌属的丰度显著升高。已知醋酸杆菌属可通过激活胆汁酸受体TGR5并刺激GLP-1分泌参与胆汁酸调控，从而改善肝功能、胰岛素敏感性和葡萄糖耐量。该菌属还能促进肠道中乙酸和丁酸的产生，通过增强膳食脂肪的肠道吸收调控肥胖发展。隆堡氏菌属被认为在抗肥胖过程中发挥有益作用，研究表明高脂饮食会降低小鼠肠道中该菌属的丰度，其可能通过碳水化合物利用、代谢终产物生成及单一氨基酸发酵等途径调控脂质代谢以维持宿主健康。丁酸球菌属则被认为与体质量及脂代谢改善密切相关。因此，推测CP暴露加剧高脂饮食（HFD）小鼠体质量增长和脂代谢异常，可能与上述菌属丰度的降低存在关联。相反，狭义梭菌属的富集已被证实与促进肥胖及体质量增加相关，针对婴儿肥胖的研究发现，6月龄肥胖或超重婴儿肠道中该菌属相对丰度显著高于正常体质量婴儿，但其调控肥胖或体质量发展的具体机制尚不明确。本研究中该菌属的富集与实验动物体质量及血清总胆固醇（TC）水平升高具有同步性。此外，M组中巴恩斯氏菌属的富集现象也值得关注，已有报道表明枸杞寡糖可通过降低该菌丰度改善肠道菌群稳态。综上，这些结果表明CP处理加剧了高脂饮食小鼠肠道菌群失衡，至少部分导致了肥胖相关菌属的增殖。

据报道，肠道菌群的活性可以通过粪便样本反映出来，作为建立身体与肠道菌群之间联系的媒介。非靶向代谢组学被用于评估粪便代谢物含量，并深入研究了CP暴露对HFD小鼠代谢的特定影响。研究发现，在CP暴露组中，肠道代谢物发生了显著变化，特别是氨基酸代谢物的水平。研究表明，氨基酸作为一类新型的有效分子，对肥胖和糖尿病的发病机制有显著贡献。据报道，循环谷氨酸的水平与腹部肥胖和代谢风险有关。结果显示，粪便L-谷氨酸水平与e-WAT和体质量增加有直接关联，这与先前的研究一致。与脂肪生成和炎症相关的L-(+)-天冬氨酸，据报道在肥胖大鼠和HFD小鼠的血液中显著富集。正如本研究观察到的，通过CP治疗增加的L-(+)-天冬氨酸与体质量增加和e-WAT重量呈正相关，这与先前的研究一致。此外，与对照组相比，在CP给药后观察到其他氨基酸（如GABA和N-乙酰-L-天冬氨酸）的显著富集。GABA是一种抑制性神经递质，在肥胖小鼠的棕色脂肪组织中，由于肥胖和代谢压力而增加。此外，数据表明，改变的肠道微生物群与粪便代谢物之间存在相关性，这表明氨基酸产量的增加与丁酸梭菌丰度的减少以及巴恩斯氏菌属丰度的增加有关。此外，据报道，当酮戊二酸（来自氨基酸的能量生产的关键中间体）的排泄量增加时，表明能量生产和利用受损。这项研究发现，氧化琥珀酸表达的增加与严格意义上的梭菌菌株呈正相关。

如前所述，改变的氨基酸代谢物与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢的途径有关。粪便代谢组学数据揭示了丙氨酸、天冬氨酸和精氨酸代谢途径在代谢综合征发展过程中的参与。与几项研究一致，本研究发现肥胖与精氨酸和脯氨酸代谢紊乱之间存在联系，表明该途径的上调与肥胖和脂质浓度有关。苯丙酮酸是一种酮酸，是苯丙氨酸代谢的代谢副产物，与肥胖有关。由于代谢紊乱导致苯丙氨酸浓度增加，导致其转化为苯丙酮酸而不是酪氨酸。在本实验中，暴露于CP显著提高了苯丙酮酸的浓度。代谢途径富集分析表明，暴露于CP时苯丙氨酸代谢显著减少。斯皮尔曼相关性分析表明，苯丙酮酸与血清LDL-C、肝TC和体质量增加之间存在明显的正相关。总之，数据表明，CP通过扰乱这些代谢途径和代谢物，加剧了HFD喂养小鼠的代谢紊乱并促进了肥胖。

除了氨基酸代谢物的变化外，还观察了农药处理对OEA的影响。先前的研究表明，过量脂肪摄入会导致啮齿类动物OEA水平降低，而OEA补充剂显示出抗肥胖效果。作为PPARα激动剂，OEA通过激活PPARα刺激脂肪分解。同样，熊果酸，另一种具有抗肥胖作用的PPARα激动剂，据报道能够通过PPARα途径改善HFD引起的代谢紊乱。与之前的发现一致，本研究观察到CP治疗后OEA和熊果酸浓度显著降低。CP可能通过减少OEA和熊果酸的生成来加剧小鼠在HFD喂养时的脂肪积累。Spearman相关性分析显示，狭义梭菌属的相对丰度增加与OEA和熊果酸的减少有关，进而导致小鼠PPARα表达的降低。个体代谢物，如OEA和熊果酸，可以作为潜在的生物标志物来理解这些变化。

基于当前研究的结果，可以推测CP对肥胖的影响可能通过肠道微生物群的失调而发挥作用，进而改变参与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及苯丙氨酸代谢途径的特定肠道代谢物。OEA和熊果酸等个体代谢物与这些变化有关。然而，本研究存在一定的局限性。虽然控制组和实验组小鼠的微生物群、代谢物和表型之间存在相关性，但这些因素之间的因果关系尚未得到确证。从研究中得出的结论，即CP暴露促进HFD诱导的肥胖并改变肠道微生物群，进而导致代谢紊乱，尚未在无菌或抗生素处理的小鼠中得到验证。因此，未来的研究将探索这些方面，结合现有文献的综述，以深入了解CP在HFD喂养小鼠中的促肥胖作用机制。

Chlorantraniliprole exposure aggravates high-fat diet-induced metabolic disorders in mice by regulating gut microbiota and its metabolites

Ting Gua,b,#, Jie Linc,#, Jiani Yanga, William Mumbyc, Quancai Sunc,*, Ye Pengb,*

a School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China

b Faculty of Medicine, Macau University of Science and Technology, Macao 999078, China

c Department of Health, Nutrition, and Food Sciences, Florida State University, Tallahassee 32306, USA

# Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Food contaminants, particularly insecticides, are important factors contributing to obesity and other adverse effects. As the most widely used diamide insecticide worldwide, chlorantraniliprole (CP) is ubiquitous in food and the environment. However, the influence of CP on obesity and the gut microbiota remains unknown. In this study, we administered CP/carboxymethyl cellulose sodium to C57BL/6J mice with a high-fat diet (HFD) via gavage for 13 weeks. The CP exposure induced significant increases in body weight gain, fat mass, serum total cholesterol (TC), and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C). Moreover, CP aggravated the imbalance in the gut microbiota by increasing the relative abundance of obesity-associated bacteria and reducing the relative abundance of beneficial bacteria. Based on untargeted metabolomics analysis, CP was found to be involved in the regulation of pathways including Alanine, aspartate and glutamate metabolism and Arginine and proline metabolism. Notably, CP exposure primarily induced alterations in microbial metabolites within these pathways, such as L-(+)-aspartic acid and L-glutamic acid. Additionally, individual metabolites, such as the lipid mediator (oleoyl ethanolamide), also demonstrated alterations upon CP exposure. Furthermore, Spearman correlation analysis revealed several noteworthy associations between microbial alterations, metabolite changes, and phenotypes. The results of the study demonstrate a connection between microbiota, metabolites, and the effects of CP exposure on HFD-induced obesity, elucidating the critical role of the gut microbiota and its metabolites in the toxic effects of CP.

Reference:

GU T, LIN J, YANG J N, et al. Chlorantraniliprole exposure aggravates high-fat diet-induced metabolic disorders in mice by regulating gut microbiota and its metabolites[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(1): 9250079. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250079.

翻译： 罗敬（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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