“看清”生命

（来源：光明日报）

转自：光明日报

光明图片/视觉中国

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“高维超分辨成像”技术。作者供图

细胞是生命的基本单位，内部结构复杂而精密。每一个细胞都像一座微型城市，拥有“发电厂”（线粒体）“物流中心”（高尔基体）“垃圾处理站”（溶酶体）“信息高速公路”（内质网）等多种细胞器。这些细胞器各司其职，又密切协作，犹如奏响生命的交响乐一般，在时空上密切配合，共同维持着生命的运转。然而，要同时看清这些细胞器的结构和动态，一直是科学家面临的巨大挑战。近年来，随着超分辨成像技术和人工智能的飞速发展，北京大学的科研团队与合作者联合开发出一种全新的“高维超分辨成像”技术，成功实现了对活细胞内15种细胞器的同时成像与精准识别，为细胞生物学研究打开了一扇全新的大门。

从“看不到”到“看得到”

细胞器种类繁多，个头又很小。有多小呢？一个细胞的直径在10微米左右，只有一根头发丝直径的约1/10。在如此狭小的空间内，细胞将多种不同的细胞器紧密而有序地组织起来，进行着复杂而忙碌的信息与物质传递，形成了一个功能完备的微观世界。这些细胞器的尺寸往往在几十到几百纳米之间，且相互紧密排列。

以我们熟悉的涮羊肉为例，一片羊肉片的厚度大约2～3毫米，是细胞尺寸的200～300倍。如果我们有“庖丁解牛”的技艺，能够将这片羊肉片持续切出200片，那么就得到一个细胞厚度的样品。可以想象，这片“薄如蝉翼”的肉将是高度透明的。样品越薄，其吸光度越低，整体呈现指数衰减——这就是著名的比尔定律。也正因此，在高度透明的细胞中，每个细胞器就更薄、更透明，也更加难以观察到。

为了应对透明的细胞，一个非常简单的方法就是给所要观察的细胞或细胞器染色——也就是让不同的细胞或者细胞器吸收不同的染料，从而变得更容易看到。这种方法的学名叫“病理染色”。直到现代，医疗中也仍在广泛应用这种方法，甚至成为临床鉴定肿瘤良恶性的“金标准”。通过用苏木素-伊红两种染料对10微米左右厚度的组织切片进行染色，我们可以在显微镜下看到细胞核呈现深蓝黑色，肌肉组织和细胞呈现不同程度的粉红色，从而能够快速判断多种疾病。

但是，当我们进行活细胞观察时，这个方法就有些力不从心了：活细胞往往只能吸收极低浓度的染料，染料浓度一增加，就足以影响细胞正常功能，甚至将细胞毒死。

那么，有没有什么办法，让我们用极低浓度的染料，就能够“点亮”细胞器呢？

为了实现这一点，科学家想到，如果让吸收染料的细胞器主动发光，是不是就能像港口的灯塔那样，即使发出的光非常微弱，但由于背景是黑色的，也能被灵敏地捕捉到。这就是目前生命科学研究中常用的荧光成像技术：我们通过开发专门识别某一类细胞器的荧光染料，让这种细胞器“发光”，从而研究它的形态与功能。

从“看不清”到“看得清”

再来说说，用什么“看”细胞。当然是显微镜。

但是，传统的光学显微镜受限于光的衍射极限，只能看到约200纳米以上的结构，大约是可见光波长的1/2。

电子显微镜能看得更清楚。电子具有质量，其物质波波长极短，因此具有非常高的分辨率。但电子显微镜看不了“活”细胞——当我们将细胞放在电镜下，用电子对其进行轰击前，首先需要抽真空，通过高真空环境让电子能够顺利地到达细胞。而活细胞含水丰富，在真空中会迅速脱水死亡。同时，高能电子束的能量达到几百电子伏特，会直接电离生物分子，造成不可逆损伤。此外，在电子显微镜成像前，样品必须经过固定、脱水、重金属染色等复杂步骤，彻底破坏细胞活性。

为了既得到高清晰、高分辨率的图像，又保持细胞活性，还要能够看到特定的细胞器，科学家又将目光重新投向光学显微镜。

通过不同的物理原理，科学家开发了多种超分辨成像技术，如结构光照明显微镜（SIM）、受激发射损耗显微镜（STED）和单分子定位显微镜（PALM/STORM）等。这些技术通过不同的物理机制，突破了光学衍射极限，使得分辨率提升至几十纳米甚至更高。这一技术也在2014年获得了诺贝尔化学奖。

从“看得清”到“看得多”“看得准”“看得深”

荧光成像技术通过特异性染色标记，能够对不同的细胞器进行标记，这时，只需要正确区分这些标记，我们就能够对其进行成像。比如，让微丝、微管、细胞核分别发出红绿蓝三色，就能区分它们，从而拍摄其形态与相互作用。

这个方法很快遇到一个问题：细胞里有30多种细胞器，如果采用特异性荧光染色，由于每种荧光的光谱很宽，会相互有串扰（信号混叠），因此无法对4种以上的细胞器进行准确区分。

为了解决串扰问题，科学家采取了两种策略：一是哥伦比亚大学教授闵伟利用一些光谱极窄的拉曼染料，实现了多种细胞器的标记与成像；二是诺奖得主Eric Betzig在探测器上下功夫，通过探测器的光谱探测，让混叠在一起的荧光信号能够被准确区分开来，从而实现了6种细胞器的成像。

然而，这两种方案也有各自的不足：拉曼染料一次只能关注一个通道，导致多细胞器成像需要的时间非常长，不适合研究多细胞器同时互作；而光谱解耦的探测器方式需要将光分到不同的探测通道，造成光子利用率低，能区分的细胞器少。

那么，如何能“看得多”呢？

为了实现对多种细胞器的同时成像，研究团队另辟蹊径：假设有一种染料，它可以进入研究者所有感兴趣的细胞器；进去后，它自己可以判断进入了什么“房间”，根据细胞器的特性实现变色。这样，它就能发出五颜六色的光，研究者可以通过区别这些颜色，来实现对多种细胞器的同时成像。

为了实现这一天马行空的想法，我们偶然地找到了一种染料“中等生”——尼罗红。它是一种通用的脂溶性染料，非常普通，大家在研究有膜细胞器的时候，往往会想到它。这种染料可以标记细胞内所有的膜结构，像线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、脂滴等。但它的特异性不强，无法让人准确分辨，用它拍出来的图像往往是模模糊糊一大片。

但对尼罗红的深入研究发现，它有一些非常特别的性质：尼罗红的发光特性会随着其所处环境的极性和脂质相态而变化。例如，在极性较高的膜环境中，尼罗红的发光会红移；而在非极性环境中则会蓝移，从而报告细胞器的化学“极性”。此外，尼罗红的荧光偏振特性也会因脂质膜的有序程度而发生变化：当细胞器中含有更多甘油磷脂时，尼罗红对偏振调制呈现了高速随机的分子转动，无法观察到偏振响应；而细胞器中排列致密的鞘磷脂与胆固醇，则能够限制其转动，让我们看到偏振响应，从而报告细胞器的物理“序性”。

为了解决尼罗红拍照“模模糊糊”的问题，我们结合荧光结构光超分辨显微技术，实现了清晰的细胞器成像。接下来，利用它的上述特性，我们团队开发出一种名为“光谱偏振光学断层成像”（SPOT）的新技术。SPOT技术通过同时捕捉尼罗红的发光强度、光谱和偏振信息，构建出细胞器的“光学指纹”，实现了对细胞器形态、极性和相态的多维度解析。

那么，如何能“看得准”呢？

我们引入了深度学习技术，进一步构建了一种名为Attention U-Net的神经网络模型，利用每种细胞器特异性荧光标记的图像作为训练数据，逐一教会AI如何根据尼罗红的“光学指纹”识别不同的细胞器。

经过训练，AI模型可以精准地区分出15种细胞器结构，包括线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、脂滴、核膜、细胞伪足等。

更惊喜的是，这种AI模型具有强大的迁移学习能力，能够在不同细胞系、不同显微镜平台，甚至活体组织中保持高准确率，展现出极强的通用性和实用性。

我们更解决了“看得深”难题——SPOT技术仅需单一染料染色，结合超分辨成像与AI分析，即可在活体组织中实现多细胞器成像。研究团队成功实现了在不同细胞有丝分裂周期、果蝇幼虫精巢等生物样品中的活细胞多细胞器超分辨动态互作网络解析。这一突破为研究活体组织中的细胞器功能、发育过程和疾病机制，提供了一种全新的研究范式和工具。

诺奖得主Eric Betzig教授这样评价：“（这一发明）从寥寥几个光谱不同的标记物中分类和量化数十种膜结构的性质，从而解决了活细胞荧光显微镜的主要局限之一。”

这项研究的意义，更在于它为生命科学研究开辟了全新的维度，不仅让我们看见了生命的细节，更理解了生命的本质。通过长期、实时、高分辨率地观察细胞器的动态变化，科学家可以更深入地理解细胞分裂、代谢、信号传导等基本生命过程。此外，该技术还可用于药物筛选、疾病诊断、再生医学等领域。例如，通过观察药物对细胞器的影响，可以快速评估药效和毒性；通过比较健康与病变细胞的细胞器差异，可以寻找新的疾病标志物。

未来，随着技术的不断完善和应用的拓展，我们有理由相信，人类将在这场“看见生命”的伟大征程中，走得更远，看得更清。

（作者：席鹏，系北京大学未来技术学院教授）