神经环路应用（8）：检测脑内多巴胺动态的工具

多巴胺（DA）作为中枢神经系统关键单胺类神经调质，参与奖赏与强化学习、运动功能、记忆巩固、情绪控制等，其脑区支配存在高度空间异质性（如伏隔核 NAc、纹状体为密集支配区，内侧前额叶皮层 mPFC、杏仁核为稀疏支配区）。传统传感器灵敏度不足，难以检测稀疏支配区 DA 释放及紧张性释放；红色荧光传感器性能（亮度、动态范围）显著差于绿色传感器；缺乏可与光遗传学、其他神经化学信号同步成像的工具。新一代高灵敏度、高选择性、宽浓度检测范围的双色（绿色/红色）GRABₙₐ传感器可解析密集与稀疏支配脑区 DA 的时空动态。筛选 GRABₙₐ传感器旨在获得能高效、准确检测多巴胺的工具，其筛选标准主要围绕传感器性能的关键指标。

新一代GRABₙₐ传感器设计步骤

受体scaffold选择克隆不同物种来源的多巴胺（DA）受体亚型作为骨架，包括人、牛、红火蚁等物种的D₁R（多巴胺1型受体）、D₂R（多巴胺2型受体）。选择多样化的受体亚型，能够提供不同的结构基础，从而优化传感器与多巴胺的结合特性以及信号传导特性。

关键结构改造：

1. ICL3替换：将受体第三胞内环（ICL3）替换为现有传感器（如GRAB、dLight）的ICL3，优化受体与荧光蛋白的耦合效率，提升响应性能。

2. Linker优化：调整连接受体与荧光蛋白（cpFP）的linker长度和序列，确保多巴胺结合后能有效传递构象变化，增强信号。

3. cpFP突变：突变cpFP中影响折叠或荧光的关键残基，提高荧光强度和稳定性。

4. 配体结合位点改造：修饰GPCR配体结合口袋，优化传感器对多巴胺的亲和力与选择性。

阴性对照构建： 在GPCR配体结合口袋引入失活突变（如gDA3mut、rDA2mut、rDA3mut），生成无法结合多巴胺的对照传感器，用于排除非特异性信号，验证检测特异性。

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筛选步骤

1. 构建变体库：通过多种改造策略，构建包含5000余个传感器变体的库。

2. 筛选标准：以基础亮度和多巴胺引起的荧光变化幅度（ΔF/F₀）为主要指标，确保高可检测性和高灵敏度。

3. 筛选与确定：经多轮检测与比较，从库中筛选出6种性能优异的核心传感器（gDA3m/h, rDA2m/h, rDA3m/h），在灵敏度、选择性和信号强度方面表现突出，满足多巴胺检测需求。

神经化学特异性：对谷氨酸、GABA、乙酰胆碱等 10 余种神经递质/调质无响应，对 DA 的敏感性比结构相似的去甲肾上腺素（NE）高 2080 倍；

受体特异性：D₁R 基传感器（gDA3m、gDA3h、rDA3m、rDA3h）仅被 D₁R 拮抗剂 SCH23390 阻断，D₂R 基传感器（rDA2m、rDA2h）可被 D₁R 和 D₂R 拮抗剂阻断（因红火蚁 D₂R 与人同源性低）。

动力学与光稳定性

响应速度：快速线扫描共聚焦显微镜显示，所有传感器的信号上升时间常数 τₒₙ≈80ms，信号衰减时间常数 τₒff 根据亲和力不同为 0.63s；

蓝光兼容性：rDA1m、rDA2m/rDA2h 无 488nm 蓝光诱导的光激活，可与蓝光光遗传工具（如 ChR2）兼容，而 RdLight1、rDA3m/rDA3h 存在光激活；

长期稳定性：在 100μM DA 持续作用 2h 后，荧光响应稳定，几乎无 Arrestin 介导的内化或脱敏。

生物安全性：通过荧光素酶互补实验和 Tango 实验验证，所有传感器均不耦合 G 蛋白介导的信号通路和 β 抑制蛋白信号通路，不会干扰细胞生理功能。

应用案例解析

• 交配行为实验案例

通过病毒工具标记伏隔核（NAc）神经信号，结合激素处理雌性小鼠，精准记录雄性小鼠交配时的神经动态。

1. 实验对象与分组

雄性小鼠：8-9周龄 C57BL/6N 小鼠，作为“行为主体”，脑内注射病毒标记多巴胺（rDA3m）和 cAMP（GFlamp1）信号。

雌性小鼠：同品系、同龄但卵巢切除（OVX） → 目的是通过外源激素精准调控发情周期，避免自然周期波动干扰实验；实验前3天需分阶段注射激素：

第1天：雌激素（50 μl，0.2 mg/ml ）

第2天：雌激素（50 μl，0.1 mg/ml ）

第3天：孕酮（50 μl，1 mg/ml ）

→ 模拟“发情状态”，确保对雄性小鼠产生稳定交配吸引。

2. 神经信号标记方法

向雄性小鼠NAc注射混合病毒：

AAV-hsyn-rDA3m（300 nl）：标记多巴胺（DA）信号的荧光传感器

AAV-hsyn-Gflamp1（300 nl）：标记环磷酸腺苷（cAMP）信号的荧光传感器

→ 作用：通过光纤记录法同步记录交配行为中 DA 与 cAMP 的动态关联。

3. 行为学与信号分析

行为定义：将交配行为细分为嗅闻（sniffing）、爬跨（mounting）、插入（intromission）、射精（ejaculation）等阶段，标准化分析。

信号变化通过ΔF/F₀计算：以引入雌鼠前15分钟的平均荧光值作为基线（F₀），锚定静息状态；ΔF为交配过程中实时荧光与基线的差值，反映神经活动引起的信号波动；ΔF/F₀为标准化后的相对变化，可消除个体差异，准确量化神经动态。

同步追踪 NAc 区 DA（rDA3m）与 cAMP（GFlamp1）信号，验证“多巴胺 → cAMP 通路”在交配行为中的动态关联；

为解析“奖赏环路（如NAc）如何编码社交行为”提供直接的神经化学证据。

• 足部电击（Foot shock）实验案例

通过病毒标记基底外侧杏仁核（BLA）的神经信号，结合电击刺激，记录小鼠的神经动态响应。

1. 实验对象与分组

8-9周龄雄性C57BL/6N小鼠（行为学实验常用品系，遗传背景稳定 ）。双侧注射BLA（基底外侧杏仁核，情绪、应激相关脑区 ）：

通用：AAV-hsyn-eCB2.0（300 nl）→ 标记内源性大麻素（eCB）信号的荧光传感器

分组：

组1：AAV-hsyn-rDA2m（300 nl）→ 标记多巴胺（DA）的rDA2m传感器

组2：AAV-hsyn-rDA1m（300 nl）→ 标记多巴胺（DA）的rDA1m传感器

→ 作用：对比不同DA传感器在应激（电击）中的响应差异，验证rDA2m对BLA区DA检测的灵敏性。

2. 电击刺激范式

环境：小鼠置于“shock box”（电击箱，可控应激环境 ）。

刺激参数：

电击强度：0.7 mA（温和到中度应激，既激活神经环路，又避免过度损伤 ）

电击时长：单轮2秒（2 s pulses ）

轮次/间隔：共5轮，轮间间隔90 120秒（让神经信号恢复基线，避免叠加干扰 ）

→ 目的：标准化应激刺激，确保多轮实验数据可重复、可比。

3. 信号分析方法

信号分析采用ΔF/F₀方法：以第一轮电击前2秒的平均荧光值作为基线（F₀），用于锚定“静息态”信号并排除前期适应干扰；ΔF为电击过程中实时荧光与基线的差值，用于量化eCB、DA等神经信号的波动幅度。

总结

本研究通过“靶向标记—标准化刺激—精准量化”的实验链，实现了对目标脑区神经化学信号的高精度解析。

文献引用：

• Zhuo Y, Luo B, Yi X, Dong H, Wan J, Cai R, Williams JT, Qian T, Campbell MG, Miao X, Li B, Wei Y, Li G, Wang H, Zheng Y, WatabeUchida M, Li Y. Improved dualcolor GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo. bioRxiv [Preprint]. 2023 Aug 25:2023.08.24.554559.

• Sun, F. et al. Nextgeneration GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo. Nat. Methods 17, 655 1156–1166 (2020).

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