神经环路应用（6）：双光子钙成像技术应用示例

双光子钙成像技术（2P imaging）基于双光子激发荧光原理，通过使用波长较长的红外激光（通常为脉冲红外激光），使荧光指示剂（GCaMP6f、GCaMP7s）在被激发时产生荧光信号。其核心在于，荧光分子需要同时吸收两个光子才能被激发，这使得激发光仅在激光焦点处产生荧光信号从而实现对组织深处（如大脑皮质）的高分辨率成像，且对组织的光损伤较小。在神经科学研究中，由于神经元活动时会伴随细胞内钙离子浓度的升高，而钙指示剂会与钙离子结合并发出荧光，因此通过检测荧光信号的变化（如dF/F₀，即荧光相对变化），可以间接反映神经元的活动状态，实现对大量神经元（包括不同类型的兴奋性神经元和抑制性中间神经元）活动的实时监测。这种技术能够在活体动物中，以较高的时间分辨率和细胞水平的空间分辨率记录神经活动，从而揭示神经过程中不同细胞类型的动态变化。

以癫痫研究为例：

因此，双光子激光扫描显微钙成像已成为研究癫痫发作和癫痫的有力工具。该技术能够大规模在体记录神经活动，可广泛应用于实验模型中对大脑皮层局部与全局神经环路机制的研究，从而在癫痫的临床前模型中架起连接单个神经元活动与全脑活动之间的桥梁。

Fig1 双光子钙成像技术研究癫痫实验示意图

头部固定的小鼠在跑球上（模拟自由活动）搭配双光子显微镜（用于钙成像）、温度探头（诱导癫痫发作），同步记录神经电信号（蓝紫色波形）。

优势

• 高空间分辨率：

能够实现细胞水平的成像，可分辨特定神经元亚类的活动，清晰揭示不同细胞类型在癫痫发作中的招募模式。

• 适用于活体研究：

可在清醒、行为状态的实验动物（如头部固定的小鼠）体内进行成像，能同时结合体温、运动等行为学指标，研究自然状态下的神经活动与行为的关联。

• 减少光损伤：

采用红外激光，对生物组织的光损伤较小，有利于进行长时间稳定的成像记录，适合观察癫痫发作等较长时程的神经过程。

• 大规模记录：

能够同时记录大量神经元的活动，有助于分析神经网络层面的动态变化，弥补了微电极阵列记录密度有限的不足。

实验步骤

采用 Scn1a⁺/⁻小鼠（Dravet 综合征模型），该模型因 SCN1A 基因突变导致钠离子通道功能异常，表现为温度敏感性癫痫等特征。分为Scn1a.PV-Cre、Scn1a.SST-Cre、Scn1a.VIP-Cre，并以野生型小鼠为对照。

对6至10周龄小鼠在其疾病慢性期进行手术。小鼠通过吸入异氟烷（4–5%用于诱导，0.8–2%用于维持，氧气流速0.5 L/min）进行麻醉。使用手持钻头在目标区域进行3 mm颅骨开窗，移除骨瓣以暴露硬脑膜并用微探针去除硬脑膜。在相距300–500 μm的2–4个位点注射AAV9.hSyn.GCaMP6f.WPRE或AAV9.hSyn.GCaMP7s.WPRE病毒。将一个直径为3 mm的玻璃盖玻片通过光学胶粘附到一个5 mm的玻璃盖玻片上制成“塞子”，插入颅骨开窗处，并使用氰基丙烯酸酯胶水将“塞子”和不锈钢头固定板粘合到颅骨上，再用牙科水泥覆盖加固。

利用双光子钙成像技术，在清醒、头部固定的小鼠模型中，以细胞水平分辨率研究癫痫发作机制，重点分析不同类型中间神经元的作用。使用定制的双光子激光扫描显微镜，以 30Hz 频率成像，结合 GCaMP6f/7s 钙指示剂标记神经元。使用定制的2P激光扫描显微镜对头部固定的清醒小鼠进行成像，同时记录小鼠的跑步速度和面部特征视频（包括瞳孔大小和胡须运动）。

行为学记录：

同步监测核心体温、运动速度、瞳孔直径和胡须运动。

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数据分析

计算 dF/F₀（荧光相对变化）；利用行为分析软件分析行为数据。

行为数据的分析整合了跑步速度、瞳孔直径和胡须运动。使用相机记录瞳孔及胡须上的关键点，并通过行为分析软件进行追踪。通过拟合瞳孔坐标点生成圆形以计算瞳孔直径；基于阈值对胡须关键点的运动进行“开启”或“关闭”状态的划分。

Fig2 图示为在清醒、头部固定、自由行为的癫痫小鼠模型中，同步采集多模态行为数据与双光子成像数据的示例，记录期间小鼠体温持续升高

（A）体温（°C）；

（B）跑步速度（mm/s）；

（C）瞳孔直径（像素）；

（D）胡须运动（向上偏转为“开启”，向下为“关闭”）；

（E）热图显示各神经元（y轴）在时间进程（x轴）中的荧光变化（ΔF/F₀）。白色虚线表示癫痫发作起始时间。

该多模态记录方法实现了在自由行为状态下对神经活动与复杂行为特征（运动、觉醒、感觉门控等）的同步监测，有助于揭示癫痫发作期间神经动态与行为改变之间的关联。

小结

在动物自然行为过程中，以高分辨率（单个神经元甚至树突、突触水平）记录大脑神经活动，可以揭示“神经活动”与“行为”之间的因果关系。使用行为分析工具自动识别面部表情、肢体动作，进而与神经活动同步分析，实现神经-行为高通量定量关联。

文献引用：

• Somarowthu A, Goff KM, Goldberg EM. Two-photon calcium imaging of seizures in awake, head-fixed mice. Cell Calcium. 2021 Jun;96:102380. doi: 10.1016/j.ceca.2021.102380. Epub 2021 Feb 22.

• Vogt, N. Two-photon imaging in freely behaving mice. Nat Methods 19, 518 (2022). https://doi.org/10.1038/s41592-022-01502-6

• Bartos M, Vida I, Jonas P, Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks, Nat. Rev. Neurosci 8 (2007) 45–56. 10.1038/nrn2044

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