平行性检验在ELISA四参数模型和平行线模型数据分析中的应用

中文摘要

目的探讨平行性检验在未涉及生理活性生物体的ELISA四参数模型和平行线模型数据分析中的应用。

方法在未进行平行性检验的2种ELISA，肠道病毒71型体外相对效力插值法检测的四参数模型和肠道病毒71型抗原含量检测的平行线模型中，选取不同水平供试品检测数据，对不进行平行性检验获得的结果、平行性检验后偏离平行不显著的结果、平行性检验后偏离平行显著的结果进行一致性比较。

结果不同的数据分析模式均未导致结果波动，变异系数为2.9%~17.9%；将四参数模型插值法与偏离平行不显著结果、插值法与偏离平行显著结果进行配对t检验分析，除插值法与偏离平行显著结果对比中2.0水平P<0.001（t=0.11）外，其他组差异均无统计学意义；将平行线模型原始计算方法结果分别与偏离平行不显著结果和偏离平行显著结果进行配对t检验分析，差异均无统计学意义。

结论无论平行性检验偏离平行显著与否，其计算结果均与原始计算结果一致，经过数据分析模型筛选、进行过完整的方法学验证的ELISA，能够选择性使用平行性检验。

正文

在生物制品检测方法建立之初，首先要明确区分利用具有生理活性的生物体进行的生物活性/效价测定法和未涉及生理活性生物体的ELISA检测法。利用有生理活性生物体的方法收录于中国药典2020年版三部（药典三部）生物检定生物活性/效价测定法，收录的35种方法中有7种严格进行平行性检验。未涉及生理活性生物体的ELISA收录于药典三部生物测定法，收录的29种方法除鉴别实验或定性实验的11种方法外，均为插值法。药典三部通则3429指出，ELISA的数据定量分析方式通常是将供试品结果代入已知浓度标准曲线计算而得，可采用简单的线性模型或复杂的非线性模型。

涉及生理活性生物体的检测方法由于方法本身变异度大、生物体不可控，需同时测定供试品和标准品的剂量反应曲线，且2条曲线需平行，即供试品与标准品仅有量的不同而没有质的区别才能准确计算相对活性，是不同计算方法结果达到统一的前提。在国际人用药品注册技术协调会 M10、药典三部通则1431 生物检定统计法、美国药典（USP44）General Chaper 1034 Analysis of Biological Assay中，实验可靠性的测验标准之一即为平行性检验符合要求。未涉及生理活性生物体的ELISA常见数据分析是通过在标准曲线上的插值确定待测物浓度，或比较标准曲线和待测物的响应曲线以检测待测物相对于标准品的相对效力。近几年我国部分ELISA在方法开发和验证阶段参考药典三部通则9401 生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则和1431生物检定统计法完成，根据生物检定统计法要求进行实验可靠性评估，其中1项为平行性检验。本研究拟通过插值法确定待测物浓度的四参数模型（以下简称为四参数）拟合数据、未进行平行性检验的平行线模型数据（以下简称为平行线模型），以2组数据分析平行性检验在未涉及生理活性生物体的ELISA中的应用。

1

材料与方法

1.1

主要材料和仪器

肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）抗原含量检测标准品（批号202002）购自中国食品药品检定研究院；EV71原液由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品八室提供；EV71半成品为自配样品；EV71抗原含量检测试剂由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品九室提供；EV71体外相对检测试剂为自建体系；多功能酶标仪BioTek epoch2购自美国BioTek公司，配套分析软件为Gen5；四参数模型平行性检验软件为JMP软件；平行线模型平行线检验软件为中国食品药品检定研究院研发的Statistical Analysis。

1.2

数据

插值法确定待测物浓度的四参数模型数据为EV71体外相对效力检测方法验证数据，0.5、0.7、1.0、2.0验证水平即为检测范围。平行线模型数据为EV71抗原含量检测数据，水平1、水平2分别为低、高检测值。

1.3

不进行平行性检验的数据分析

1.3.1　四参数模型EV71体外相对效力检测方法为四参数模型数据分析，采用插值法计算供试品相对效力。标准品与供试品均2倍线性稀释7~8孔，双复孔上样取均值计算，在Gen5软件中以标准品效价理论值（横坐标）与其对应的检测吸光度值（纵坐标）进行logistic Rodbard四参数曲线拟合。将供试品各个稀释度检测吸光度值代入公式计算相对效价，最终选取供试品对应标准品吸光度值范围内各稀释度相对效价均值作为最终效价。

四参数模型方程：Y=（A-D）/［1+（X/C）B］+D。该方程为S型曲线，参数A为曲线上渐近线，D为下渐近线，C为半数反应处的浓度或效价，B为斜率。

1.3.2　平行线模型EV71抗原含量检测方法采用平行线模型计算供试品抗原含量，标准品和供试品均为直线线性拟合。标准品与供试品均2倍线性稀释7~8孔，双复孔上样取均值，分别选择cutoff值以上5个稀释度吸光度值代入公式计算抗原含量。数据分析方式同药典三部3502甲型肝炎疫苗体外相对效力检查法（等反应剂量比值）。

1.4

进行平行性检验的数据分析

1.4.1　四参数模型采用JMP软件对标准品和供试品的量效曲线分别进行平行性检验，程序为：采用约束模型，即模型中除C值外共享所有参数，以F-prob作为判断2条曲线是否平行的标准，当F-prob≥0.05时，判定2条曲线平行，反之判为不平行。在进行平行性检验过程中可删除标准品或供试品上端或下端点，选取至少5个连续的点进行曲线拟合并评价平行性。当标准品和供试品量效曲线平行时，二者半数效应浓度（median effect concentration，EC50）非常接近，用等反应剂量比值（C值比值）计算样品相对效价可代表最终结果。

无论平行与否均按以下公式计算相对效价（斜率比）：

其中EC50即为约束模型下量效曲线中的C值。

1.4.2　平行线模型采用Statistical Analysis中Parallel Line Assay模块对标准品和供试品量效曲线进行平行性检验，根据F-prob判断2条曲线是否平行、直线回归是否有意义，当F-prob（直线回归）、F-prob（平行）均≥0.05时，判定2条直线偏离平行、偏离线性均不显著。在进行可靠性检验时，可删除标准品或供试品上端或下端点，标准品至少选取4个连续的点、供试品至少选取3个连续的点进行线性和平行性检验。

无论平行与否均按以下公式计算相对效价：

供试品抗原含量=标准品抗原含量×R

其中R为标准品和供试品等反应剂量比值。

1.5

统计分析

采用JMP软件对不进行平行性检验获得的结果、偏离平行不显著结果、偏离平行显著结果进行配对t检验，对不同的结果进行一致性比较。

2

结果

2.1

四参数模型结果

累积30组左右EV71体外相对效力检测数据，对各水平数据分别进行插值法计算、偏离平行不显著数据计算、偏离平行显著数据计算。大部分数据标准品和供试品偏离平行不显著，结果见表1，插值法和偏离平行不显著结果变异系数相近。部分数据标准品和供试品偏离平行显著，结果见表2，插值法和偏离平行显著结果变异系数接近。说明不同的数据分析模式均未导致结果波动。

将插值法与偏离平行不显著结果、插值法与偏离平行显著结果进行配对t检验统计分析，除了插值法与偏离平行显著结果对比中2.0水平P<0.001，其他组差异均无统计学意义，见表3。分析插值法与偏离平行显著结果对比中2.0水平数据发现，虽然偏离平行显著组计算结果明显低于插值法，但插值法结果更接近于2.0理论值。

2.2

平行线模型

累积50组左右EV71抗原含量检测数据，分别对不同水平供试品进行原始计算方法、偏离平行不显著数据计算、偏离平行显著数据计算。大部分标准品和供试品偏离平行不显著，结果见表4，原始计算结果和偏离平行不显著结果变异系数相近。部分数据标准品和供试品偏离平行显著，结果见表5，原始计算结果和偏离平行显著结果变异系数接近。说明不同的数据分析模式均未导致结果波动。

将原始计算结果与偏离平行不显著结果、原始计算结果与偏离平行显著结果进行配对t检验统计分析，差异均无统计学意义，表明无论偏离平行显著与否结果均与原始计算结果一致，见表6。

3

本研究数据来源于未涉及生理活性生物体的ELISA的2种数据分析模式，分别为插值法的四参数模型数据和不进行平行性检验的平行线模型数据，分析不进行平行性检验的原始计算结果、进行平行性检验的偏离平行不显著结果和偏离平行显著结果之间的差异，结果显示ELISA数据进行平行性检验偏离平行与否均不影响检测结果的准确性与可靠性。有研究也得出相关结论，平行性检验通过的量反应平行线法和插值法无差异。有学者在ELISA开发过程、验证阶段评价标准品和供试品数据剂量反应曲线的平行性，在检测过程中不进行平行性检验，即平行性检验并非实验必要操作。本研究数据同样得出平行性检验通过与否和插值法结果均无差异、平行性检验非必要操作的结论，前提是在ELISA建立过程中经过数据分析模型筛选，进行过完整的方法学验证，确定该检测方法检测数据稳定、准确。插值法与偏离平行显著结果对比中2.0水平P<0.001，由于该水平为检测范围上限200%，已远超检测范围上限，因此结果有偏离是正常的，且本检测方法中使用的已验证的插值法结果准确度更高。

在EV71体外相对效力ELISA开发过程中，使用了BioTek epoch2酶标仪自带软件Gen5四参数logistic Rodbard进行模型拟合，采用插值法进行数据分析。较宽浓度范围样品虽能够在ELISA中产生直观的浓度-吸光度值S型曲线，也是四参数检测体系的优势，但定量范围仅限于曲线的陡峭部分，以避免插值误差。本研究所用的多点插值求均值法与WHO 2013年推荐的肺炎链球菌荚膜多糖型特异性IgG抗体定量ELISA标准方法指导文件中采用的计算方法相同，即将连续稀释样品中各稀释度吸光度值代入四参数标准曲线中计算浓度，以最终均值作为样品浓度值，并对数据做了限定：复孔变异系数大于15%则排除在外，多次稀释的浓度数据变异系数超过30%则需要重新测定。这种多点插值求均值计算形式较单点插值法更准确，因单点插值仅采用1个稀释度样品吸光度值带入标准曲线计算浓度，所以产生偏差的概率较高。研究中四参数模型2.0水平插值法和偏离平行显著数据结果也支持此结论，标准品和供试品量效曲线平行性检验通过得出的结果较多点插值求均值的方法准确度差，由此可知多点插值求均值更能准确应用于ELISA数据分析中，同时平行性检验并非必要操作。

平行性检验在质量控制中发挥着重要作用，需根据检测方法本身的变异范围、检测需求对平行性检验的使用进行评估，在未涉及生理活性生物体的ELISA中并非必要实验操作。

作者

刘正玲1 赵勇2 蒋曦2 李娅娴2 杜宋婷2 杨富茜2 赵红2 李亚东2

1中国医学科学院医学生物学研究所生物制品九室，昆明 650503；2中国医学科学院医学生物学研究所质量检定室，国家药品监督管理局疫苗及生物制品质量控制与评价重点实验室，昆明 650503

刘正玲和赵勇对本文有同等贡献

通信作者：李亚东，

Email：yadong_li@imbcams.com.cn

引用本文：刘正玲, 赵勇, 蒋曦, 等.平行性检验在ELISA四参数模型和平行线模型数据分析中的应用[J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(4): 247-252.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241106-00070

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