科学家在大肠杆菌中构建“突变工厂”，一周提升耐药性5000倍

蛋白质是生命活动的核心分子，其结构和功能直接决定着生物体的生理特性和生化反应效率。无论是药物研发、工业酶制造，还是新型生物材料设计，精准改造蛋白质都是核心任务。

然而，传统的蛋白质改造主要依赖定向进化（directed evolution）技术，研究人员需要反复进行三步循环：对目标基因引入突变、在选择压力下筛选优良变体、保留最佳版本作为下一轮进化的起点。这一方法虽然有效，却存在周期长、效率低、可扩展性差等瓶颈，难以满足新药开发、抗性预测等对速度和规模的高要求。

为了突破这一瓶颈，近日，美国斯克里普斯研究所化学生物学系 Peter Schultz 研究团队在Science杂志发表了一篇题为“An orthogonal T7 replisome for continuous hypermutation and accelerated evolution in E. coli”的研究论文，他们开发了一种全新的蛋白质进化平台——T7-ORACLE。它利用噬菌体 T7 的复制机制，在大肠杆菌中构建了一个“突变工厂”，能够在不影响宿主细胞稳定性的前提下，将目标蛋白质的进化速度提升数千倍，实现快速、高通量的功能优化，仅用一周时间就让 β-内酰胺酶对抗生素的耐药性提升 5000 倍。这一成果大大加速了蛋白质工程的效率，有望在药物研发、工业合成以及公共卫生领域带来颠覆性影响。

T7-ORACLE 的核心原理，是在细胞内建立一个独立于宿主基因组的复制系统。该灵感来自于噬菌体 T7 体内的 T7 复制酶（T7 replisome），它能以极高速度复制病毒基因组。研究团队利用这一特点，将目标蛋白质的基因放到一个特殊的质粒上——这个质粒只被经过改造的 T7 复制酶识别和复制。因此，细胞自身的基因组依旧由大肠杆菌的高保真复制系统负责，保证细胞正常生长和稳定运行。

而目标基因所在的质粒，则由这个改造过的 T7 复制酶“特异性复制”，并且故意将复制错误率大幅提升，突变频率比正常复制高出约 105倍。

由于高频突变仅发生在这个质粒上，而不影响宿主染色体，系统实现了在不损害细胞健康的情况下，持续、快速地产生大量目标基因变异。

这就是“正交复制系统”的优势，两条复制路线互不干扰，一条负责细胞稳定生长，另一条负责目标基因快速进化。

图 | 基于 T7 噬菌体复制系统的 T7-ORACLE 的工作原理

在实际应用中，团队选择了 β-内酰胺酶作为测试对象。β-内酰胺酶是一类能分解青霉素等 β-内酰胺类抗生素的酶，在细菌耐药性研究中具有重要意义。研究人员将 β-内酰胺酶基因放入 T7-ORACLE 系统中，然后在含有不断升高浓度抗生素的环境下进行培养。结果显示，仅经过 7 天，进化出来的酶对抗生素的耐受浓度提升了 5000 倍，—这一效率是传统定向进化无法比拟的。

图 | 利用 T7-ORACLE 系统对 TEM-1 β-内酰胺酶进行连续进化实验，展示了其对抗生素耐药性的提升，以及突变位点的分布和进化路径

为了进一步验证通用性，团队又将多种不同类型的蛋白质（包括代谢酶、结合蛋白等）同时放入平台中进化。结果显示，即便在多目标并行的情况下，各蛋白的改良速度依旧显著高于传统方法，且不同进化路径之间几乎没有干扰。

值得注意的是，T7-ORACLE 不仅能在标准实验条件下运行，还可直接在高温、低 pH 或高盐等近似实际应用的环境中进行进化，从而获得环境适应性更强的变体。

在平台运行过程中，团队也面临一个关键挑战：如何避免高突变率导致无功能或有害突变的大量积累。对此，研究人员通过控制质粒拷贝数、调节 T7 复制酶的表达水平，以及在进化过程中引入动态选择压力等方式，保持了功能优化与突变多样性的平衡。

通过上述多重策略，T7-ORACLE 平台实现了高速突变与稳定筛选的良好平衡，大幅提升了进化效率的同时，避免了有害突变的过度积累。

T7-ORACLE 的技术优势主要体现在四个方面：速度优势——突变与筛选过程在细胞内连续进行，免去传统方法中多轮人工操作；高通量——可同时处理多个目标蛋白，显著提高研发并行度；安全性——突变局限于质粒，不影响宿主基因组；适应性——可直接在接近实际应用的环境中运行，提升变体的实用价值。

总之，T7-ORACLE 的出现为蛋白质重编程提供了一种全新的思路。通过将进化过程从“人工推动”转变为“自动驱动”，这一平台不仅大幅缩短了研发周期，也拓展了蛋白质工程在更广泛场景下的可行性。未来，随着该技术的进一步优化与普及，我们或将进入一个“按需定制、快速迭代”的蛋白质设计新时代。

参考文献：

1、https://www.science.org/doi/10.1126/science.adp9583

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