Sci Adv：为何小伤好了，痛却留下来了？刘伯一/方剑乔/王川团队揭示神经免疫正反馈信号机制

脑声小店基于深度科研洞察，专注为动物实验提供"简器械·精实验"解决方案。我们突破高精设备局限，开发手工定制化仪器及配件，通过科研巧思将基础工具转化为创新实验方案。产品涵盖行为学装置、操作辅助工具等，使实验室在保持操作简效的同时，实现精细化数据采集，助力科研人员以创造性思维发掘简易仪器的潜在科研价值。

2025年8月1日，浙江中医药大学刘伯一教授&方剑乔教授以及河北医科大学王川教授在Science Advances发表：Neuronal Reg3β/macrophage TNF-α–mediated positive feedback signaling contributes to pain chronicity in a rat model of CRPS-I，揭示了神经元Reg3β/巨噬细胞TNF-α介导的正反馈信号通路参与CRPS-I大鼠模型的疼痛慢性化。

复杂性局部疼痛综合征I型（CRPS-I）在初次损伤后发生，会引起持续时间超出组织正常愈合时间的长期疼痛。目前，CRPS-I疼痛慢性化的机制尚不清楚。作者发现CRPS-I大鼠模型的局部背根神经节（DRG）中存在长期的巨噬细胞浸润。在模型建立后，再生胰岛衍生的蛋白3β（Reg3β）由DRG神经元特异性产生并作为重要的信号分子驱动促炎性巨噬细胞向局部DRG的浸润。浸润的巨噬细胞产生TNF-α，导致伤害性DRG神经元兴奋性增高并反过来促进DRG神经元中Reg3β的过表达和分泌，从而招募更多的巨噬细胞。作者的研究揭示了一条由神经元Reg3β和巨噬细胞TNF-α介导的正反馈信号通路，该通路促进了DRG的神经炎症导致CRPS-I大鼠模型中的持续性疼痛。

图一 巨噬细胞侵入CRPS-I大鼠模型的DRG

作者建立了大鼠CPIP模型以模拟复杂性区域疼痛综合征I型。当在大鼠踝关节周围结扎一个O型环时，同侧后爪出现明显的组织水肿和发绀。再灌注后，同侧后爪发生水肿。尽管水肿在3天后逐渐恢复，但与假手术大鼠相比模型大鼠同侧后爪出现了持续的机械性异常性疼痛，持续时间超过3周。近期研究表明，某些免疫细胞浸润外周感觉神经节和/或神经在慢性疼痛的发生中起着重要作用。随后，作者进行了单细胞RNA测序以检测CPIP模型大鼠同侧背根神经节是否存在免疫细胞浸润。根据独特细胞标志物的表达，从单细胞RNA测序数据中鉴定出七个不同的细胞簇，包括神经元、成纤维细胞、免疫细胞等。鉴定出四种主要的细胞亚型，包括巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞和B细胞。比较了假手术组和CPIP模型大鼠免疫细胞的数量，发现巨噬细胞在DRG中的浸润量最大。免疫染色发现，与假手术大鼠相比，在模型建立7天后CPIP模型大鼠背根神经节中存在大量巨噬细胞浸润。CPIP模型大鼠背根神经节中CD68阳性细胞的数量显著上调，巨噬细胞在背根神经节中的浸润在模型建立后3天即出现，并持续到14天。在模型大鼠的坐骨神经中未观察到巨噬细胞浸润。这些发现表明，CPIP模型大鼠背根神经节中巨噬细胞数量的增加主要是由血液来源的单核细胞浸润引起的，而不是局部常驻巨噬细胞的增殖。注射含氯膦酸盐的脂质体后，CPIP模型大鼠脾脏和同侧背根神经节中的巨噬细胞数量大幅减少，表明体内巨噬细胞耗竭成功。耗竭巨噬细胞显著改善了模型大鼠的机械性异常性疼痛。该结果表明，巨噬细胞浸润局部DRG是导致CPIP模型大鼠机械性异常性疼痛原因之一。

脑声常谈建立了多个《动物模型构建与行为评估》交流群，群内分享各种经典和前沿的行为范式，共同交流解决动物实验中遇到的棘手问题，避坑少走弯路！有需要的老师可以扫码添加微信进入讨论群！

图二 Reg3β参与了CPIP模型大鼠DRG的巨噬细胞浸润和机械性异常性疼痛

接下来，作者研究了Reg3β是否参与了DRG的巨噬细胞浸润。在模型建立后，通过鞘内注射的方式每天给予CPIP模型大鼠Reg3β中和抗体或同型对照免疫球蛋白G进行治疗。与同型对照IgG相比，中和抗体治疗显著减少了CPIP模型大鼠同侧DRG中积聚的巨噬细胞数量，中和抗体治疗也显著改善了模型大鼠的机械性异常性疼痛。作者在DRG神经元中特异性敲低Reg3β以探究其在慢性疼痛中的作用。结果显示，特异性敲低Reg3β减少了CPIP模型大鼠DRG中巨噬细胞积聚，改善了机械性异常性疼痛和脊髓背角c-Fos的过表达，同时降低了同侧脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞的过度激活。进一步分析发现，在CPIP模型大鼠的DRG中，敲低Reg3β显著减少了M1样促炎巨噬细胞的浸润，而对M2样抗炎巨噬细胞无明显影响。此外，在慢性疼痛维持阶段应用Reg3β中和抗体显著缓解了机械性和热痛觉过敏。研究还表明，无论是雄性还是雌性大鼠，Reg3β均参与了慢性疼痛的发展过程并且在雌性大鼠中同样观察到了Reg3β敲低后疼痛症状的改善。最后，研究探讨了Reg3β敲低对CPIP模型大鼠厌恶行为的影响，发现特异性敲低Reg3β能够显著改善由疼痛引发的厌恶行为。这些结果表明Reg3β在调控巨噬细胞浸润、疼痛敏感性以及情感障碍方面发挥了重要作用。

图三 在正常大鼠中，靶向性在DRG神经元中过表达Reg3β可诱导巨噬细胞浸润并产生机械性异常性疼痛

作者进一步探究DRG神经元来源的Reg3β是否足以在正常大鼠中诱导巨噬细胞浸润和机械性异常性疼痛。为此，再次将表达Reg3β基因的AAV-PHP.S-hSyn病毒通过足底注射于正常大鼠的右后爪。转染八周后，与未转染大鼠相比，AAV-PHP.S-hSyn-EGFP治疗组大鼠同侧背根神经节神经元中观察到明显的绿色荧光蛋白信号。免疫印迹分析显示，转染了AAV-PHP.S-hSyn-Reg3β-EGFP的大鼠同侧DRG中Reg3β蛋白表达量更高。在DRG神经元中靶向性过表达Reg3β，导致同侧后爪机械性异常性疼痛逐渐增加。此外，伴随着行为学变化，同侧背根神经节中巨噬细胞积聚也显著增加。这些结果表明，在DRG神经元中特异性过表达Reg3β足以触发巨噬细胞浸润，并在正常动物中诱导持续的机械性异常性疼痛。

图四 TNF-α/Syk/STAT3信号通路介导了CPIP模型大鼠DRG神经元中Reg3β的过表达，进而导致巨噬细胞浸润和慢性疼痛

为了评估TNFR1/Syk/STAT3信号通路在CPIP模型大鼠疼痛机制中的体内作用，作者采用药理学方法抑制关键信号分子的活性。通过鞘内注射给药并在指定时间点采集同侧L4-L6背根神经节进行分析，发现STAT3在CPIP模型大鼠的背根神经节神经元中被激活。使用ETA阻断TNF-α显著降低了模型大鼠DRG神经元中p-STAT3的过表达；Syk也被激活，表现为CPIP模型大鼠DRG神经元中p-Syk表达增加。使用ETA或TNFR1中和抗体阻断TNF-α可显著降低背根神经节神经元中过表达的p-Syk。此外，使用Syk特异性抑制剂PRT062607可降低CPIP模型大鼠背根神经节中STAT3的激活。在CPIP模型大鼠的背根神经节中，发现p-Syk阳性神经元与p-STAT3阳性神经元存在共定位。由于STAT3信号通路参与了Reg3β的过表达，作者还探究了抑制STAT3是否能减少背根神经节的巨噬细胞浸润并缓解机械性异常性疼痛。使用S3I-201抑制STAT3可显著减少CPIP模型大鼠背根神经节中的巨噬细胞浸润并缓解机械性异常性疼痛。这些结果表明，在DRG神经元中存在TNFR1/Syk/STAT3介导的信号轴，该信号轴参与了TNF-α诱导的Reg3β过表达、巨噬细胞浸润以及CPIP模型大鼠的疼痛慢性化。

总之，作者的研究揭示了一种此前未知的正反馈信号通路，该通路由神经元Reg3β和巨噬细胞TNF-α介导参与了局部背根神经节的神经免疫相互作用和神经炎症，导致复杂性区域疼痛综合征I型大鼠模型中伤害性感觉神经元的过度兴奋和疼痛的慢性化。作者的发现可能为局部感觉神经节中的神经免疫相互作用提供新的见解，并揭示了复杂性局部疼痛综合征I管理的潜在靶点。

文章来源

10.1126/sciadv.adu4270