《中草药》例文: 基于指纹图谱与谱效关系的白头翁潜在抗氧化质量标志物（Q-Marker）分析

白头翁为毛茛科植物白头翁Pulsatilla chinensis(Bge.) Regei的干燥根[1]，始载于《神农本草经》[2]记载“白头翁，一名野丈人，一名胡王使者”，其味苦性寒，归胃、大肠经[1,3]。具清热解毒、凉血止痢之功。主要用于治疗热毒血痢、阴痒带下[1]。作为白头翁汤、白头翁丸、白头翁散等传统中药复方的君药，白头翁在治疗热毒血痢中具有重要作用。目前，对白头翁研究多集中于三萜皂苷类成分，包括齐墩果酸型和羽扇豆烷型[4]，尚含有香豆素类、木脂素类、三萜酸类等[3]，有抗氧化、抗炎、抗菌、抗疟杀虫等作用[5-6]。报道显示白头翁抗氧化作用与传统药效关系密切[5]，清除H2O2的能力强于维生素C，能够防止脂质过氧化，降低组织或者细胞损伤[7-8]。

由于白头翁历史沿革和产地变迁复杂，白头翁属植物种类多，如朝鲜白头翁Pulsatilla cernua (Thunb.) Berch et Opiz.、兴安白头翁P. dahurica (Fisch.) Spreng.等[9]，宏观形态相似，同名异物现象普遍，各地用药习惯存在差异，正品资源有限，导致其难于鉴定和质控[9-10]。另外，白头翁化学成分复杂，有效成分含量低，当前《中国药典》2020年版以白头翁皂苷B4作为质控指标[1]，而白头翁混伪品，如朝鲜白头翁等也含有白头翁皂苷B4[11]。说明仅以白头翁皂苷B4进行质控，可能影响到有效性与安全性。亟需对白头翁展开更为科学合理的质控研究[12]。本研究建立能够区分白头翁正品及其常见混伪品的HPLC指纹图谱。采用UPLC-QTOF-MS/MS表征正品白头翁化学成分。建立正品白头翁药材HPLC指纹图谱与抗氧化指标之间的谱效关系，筛选潜在抗氧化质量标志物（quality marker，Q-Marker），以体外实验验证潜在Q-Marker的抗氧化活性。

1仪器与试药

1.1仪器

超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Waters alliance acquity-e2695 高效液相色谱仪（美国Waters公司）；安捷伦液相色谱-G7116B 6546 LC/Q-TOF（美国安捷伦公司）；赛默飞U3000高效液相色谱仪（美国赛默飞公司）；JM型电子分析天平（诸暨市超泽衡器设备有限公司）；中草药粉碎机（天津市泰式特仪器有限公司）；ZF型三用紫外分析仪（杭州齐威科技有限公司）；XPR206DR型百万分之一电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Infinite F50型酶标仪（瑞士帝肯Tecan公司）；CKX41倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1.2药材

白头翁药材及其常见混伪品为自采，经哈尔滨商业大学金哲雄教授鉴定为白头翁Pulsatilla chinensis (Bge.) Regei及其常见混伪品漏芦Rhaponticum uniforum (L.) DC、朝鲜白头翁P. cernua (Thunb.) Berch et Opiz.、西南白头翁P. millefolkium (Hemsl et wils) Ulbr、蒙古白头翁P. ambigua (Turcz. ex Hayek) Juz.、兴安白头翁P. dahurica (Fisch.) Spreng.，具体见表1、2。

1.3材料与试剂

对照品白头翁皂苷B4（批号111766-201702，中国食品药品检定研究院，质量分数≥94.7%）、白头翁皂苷D（批号21012808，成都普菲德生物技术有限公司，质量分数≥99.03%）；甲醇（批号20220831）、乙腈（批号20220731）均为色谱纯，购自德国默克公司；磷酸（分析纯，批号20120311，天津市富宇精细化工有限公司）；DPPH（批号A14IS212603，成都普菲德生物技术有限公司）；L-(+)-抗坏血酸（批号20220808，天津市科密欧化学试剂有限公司）；胎牛血清（批号22060701，杭州四季青生物有限公司）；DMEM高糖培养基（批号MA0212-Nov-15l）、活性氧检测试剂盒（批号MA0219-1-Nov-28l）均购自大连美伦生物技术有限公司；一氧化氮（NO）检测试剂盒（批号052223231026，碧云天生物技术有限公司）；脂多糖（LPS，批号L2880，北京博奥拓达科技有限公司）。

1.4细胞系

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自大连美伦生物技术有限公司。

2方法与结果

2.1HPLC指纹图谱的建立

2.1.1供试品溶液的制备 取白头翁药材5 g，加7倍量水浸泡30 min，加热回流30 min，趁热滤过，药渣再加6倍量水，回流20 min，合并2次滤液，浓缩至20 mL，得到白头翁水提物。取10 mL白头翁水提物浓缩至浸膏状，用乙腈-水（10∶90）复溶，定容至10 mL，滤膜滤过，即得。

2.1.2对照品溶液的制备 精密称取对照品白头翁皂苷B4对2.75 mg与白头翁皂苷D 5.00 mg，分别用75%甲醇配制为0.275 mg/mL和0.5 mg/mL对照品溶液，滤过，4 ℃避光保存，备用。

2.1.3色谱条件 采用Welch Ultimate® XB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，10% A；5～7 min，10%～13% A；7～9 min，13%～15%A；9%～12 min，15% A；12～14 min，15%～16.4% A；14～17 min，16.4%～19% A；17～23 min，19%～23% A；23～26 min，23%～26.6% A；26～29 min，26.6%～26.6% A；29～35 min，26.6%～32% A；35～39 min，32%～35% A；39～45 min，35%～42% A；45～52 min，42%～45% A；52～62 min，45%～90% A）；柱温25 ℃；体积流量1.0 mL/min；检测波长210 nm；进样量20 μL。

2.1.4方法学考察

（1）精密度试验：取“2.1.1”项下供试品溶液（S1），在“2.1.3”项色谱条件下连续进样6次。以17号峰为参照峰，测得21个共有峰相对保留时间RSD均＜1.15%，相对峰面积RSD均＜2.73%。

（2）重复性试验：按“2.1.1”项下方法平行制备6份供试品溶液（S1），在“2.1.3”项下色谱条件进样分析。以17号峰为参照峰，测得21个共有峰相对保留时间RSD均＜1.04%，相对峰面积RSD均＜2.77%。

（3）稳定性试验：取“2.1.1”项下供试品溶液（S1），在“2.1.3”项下，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样。以17号峰为参照峰，测得21个共有峰相对保留时间RSD均＜1.10%，相对峰面积RSD均＜2.82%。

2.1.5指纹图谱建立 将18批正品及5批混伪品白头翁HPLC色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”进行分析。正品白头翁及其常见混伪品HPLC指纹图谱见图1-A，如图所示可见正品与其混伪品区分明显，混伪品与正品间相似度为0.667～0.321；18批正品白头翁HPLC指纹图谱及对照指纹图谱见图1-B，正品白头翁样品得共有峰21个，以S1为参照图谱，分离良好，峰形稳定，峰面积大的17号峰为参照峰，采用中值法进行多点校正和Mark峰匹配，生成对照图谱，计算相似度。结果白头翁药材（S1～S18）指纹图谱相似度分别为0.990、0.981、0.981、0.972、0.985、0.990、0.990、0.993、0.994、0.991、0.979、0.970、0.993、0.980、0.959、0.979、0.980、0.987，说明正品的18批白头翁饮片虽然产地不同，但其相似度较高，内在质量相对稳定。

2.2化学模式识别

2.2.1聚类分析 将正品白头翁指纹图谱中21个共有峰面积标准化导入SPSS 20.0软件聚类。如图2-A所示，聚类距离为20时，聚为4类，S7为一类，S15、S17为一类，S18为一类，其他为一类；聚类距离为25时，可分为2类，S7归一类，其他归一类。说明各样品整体质量稳定，但略有差异，无明显地域聚集性。

2.2.2主成分分析 运用SPSS 20.0软件进行主成分分析，计算主成分特征值和方差贡献率。前7个主成分的特征值均＞1，以此为标准。主成分1～7的累积方差贡献＞86.587%，具有较好代表性，能反应样品大部分的信息，可用于白头翁的质量评价。如图2-B所示，峰3、7～9、16、17、20和21在第1主成分上的载荷值较高，说明主成分1主要反映这8个成分指标信息；主成分2主要反映2、4～6、10～12和18的信息；主成分3和4分别主要反映峰15与峰1、9、13的信息；主成分5、6、7分别反映峰12、14、19的成分信息。

2.3 UPLC-QTOF-MS/MS表征

2.3.1色谱及质谱条件

（1）色谱条件：Waters ACQUITY UPLC® BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；保护柱Waters ACQUITY UPLC® BEH C18（1.7 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～6 min，5%～20% A；6～20 min，20%～39.6% A；20～33 min，39.6%～95% A；柱温40℃；进样量1 μL；体积流量0.25 mL/min。

（2）质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI）；毛细管电压3 kV；雾化器气体6.5 bar；锥形电压35 kV；锥形气体流量50 L/h；去溶剂气温度400 ℃；去溶剂气流量700 L/h；源温度120 ℃。

2.3.2化学成分表征指认 将“2.1.1”项下制备的正品白头翁样品供试品稀释，正离子模式下数据采集，利用Masslynx 4.1TM软件分析处理数据。根据图3中的保留时间，将一、二级质谱提供的准分子离子峰和碎片信息与Mass Bank等数据库，共表征出21个成分，如表3所示。

2.4谱效关系分析

2.4.1DPPH抗氧化实验 取2 mL DPPH溶液（0.04 mg/mL），加入2 mL蒸馏水（A0）。将“2.1.1”项下白头翁溶液稀释后，各取2 mL，分别加入2 mL 蒸馏水（A2）和2 mL DPPH溶液（A1）。室温反应30 min后，于517 nm处测吸光度（A）值[17]。根据公式（1）得到半数抑制浓度（IC50）值，结果见图4-A，18批正品白头翁均具有较强抗氧化能力，IC50为（1.796±0.12）～（14.433±0.23）mg/mL。

DPPH自由基清除率＝1－(A1－A2)/A0 （1）

2.4.2灰色关联度（grey relational analysis，GRA）分析 采用均值法处理原始数据，以18批白头翁的21个色谱峰面积为比较序列，IC50值设置为参考序列，计算灰色关联度，公式见（2）～（4），其中分辨系数ρ取0.5。

ξ(k)＝[min(i)min(k)|y(k)－xi(k)|＋ρmax(i) max(k)|y(k)－xi(k)|]/[|y(k)－xi(k)|＋ρ max(i)max(k)|y(k)－xi(k)|] （2）

Δi(k)＝|y(k)－xi(k)| （3）

ξi(k)＝[min(i) min(k) Δi(k)＋ρ max(i)max(k) Δi(k)]/[Δi(k)＋

ρ max(i)max(k) Δi(k)] （4）

与IC50关联度大于≥0.75为有药效，则共有峰中与抗氧化相关联的有14个峰，为峰9、6、8、10、4、15、17、5、1、19、11、3、2和21（图4-B）。

2.4.3皮尔逊分析（pearson correlation analysis， PCA） 以SPSS 26.0软件，进行共有峰和IC50之间PCA分析，峰17、20、19、21与IC50相关系数绝对值大于0.5，认为与抗氧化强相关（P＜0.01），见图4-B。

2.4.4偏最小二乘（partial least squares，PLS）分析 应用SIMCA 14.1软件，以共有峰峰面积为自变量X，抗氧化药效指标为因变量Y，建立谱效关系模型。结果如图4-C所示，依次有峰17、18、21、4、15、20、1、13、10的VIP值大于1[18]。

如图4-B右下方所示，峰17、19、21为GRA和PCA交集，结合PLS模型中VIP值共同取交集，即筛选出与DPPH氧化活性药效指标关联度最高的峰为峰17和21，可能为白头翁潜在的抗氧化Q-Marker。

2.5含量测定

2.5.1潜在抗氧化成分指认 在“2.1.3”项色谱条件下，利用白头翁皂苷B4和白头翁皂苷D对照品，对18批正品白头翁HPLC指纹图谱中17和21号峰（潜在的抗氧化标志物）进行指认及含量测定。结果确认17号峰为白头翁皂苷B4；21号峰为白头翁皂苷D，见图1-C。

2.5.2对照品溶液制备 同“2.1.2”项下对照品溶液制备方法。

2.5.3供试品溶液的制备 同“2.1.1”项下供试品溶液制备方法。

2.5.4色谱条件同“2.1.3”项下色谱条件。

2.5.5线性关系精密吸取对照品溶液，按“2.1.3”项色谱条件进样并记录结果。以其质量浓度为横坐标（X），相对应的峰面积为纵坐标（Y），计算标准曲线方程，结果白头翁皂苷B4标准曲线方程Y＝68.427 X＋3.584 5，r＝0.999 0，线性范围0.04～3.00 mg/mL；白头翁皂苷D标准曲线方程Y＝4.136 2 X＋0.529 2，r＝0.999 7，线性范围0.03～5.00 mg/mL。

2.5.6方法学考察

（1）精密度试验：取S1供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。白头翁皂苷B4与白头翁皂苷D峰面积的RSD分别为0.73%、1.12%，表明仪器精密度良好。

（2）重复性试验：平行制备6份正品白头翁S1批次供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件测定，计算白头翁皂苷B4与白头翁皂苷D含量的RSD分别为0.77%、1.75%，说明方法重复性良好。

（3）稳定性试验：取“2.1.1”项S1供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12和24 h进样分析。白头翁皂苷B4与白头翁皂苷D峰面积的RSD分别为1.27%、2.67%，表明室温条件下，供试品溶液24 h内稳定性良好。

（4）加样回收率试验：精密称取已知含量的白头翁样品（S1）6份，以1∶1比例加入2种成分对照品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，记录各成分峰面积，计算含量后求加样回收率。白头翁皂苷B4平均加样回收率为102.17%，RSD为0.80%；白头翁皂苷D平均回收率为102.00%，RSD为1.07%。

2.5.7含量测定 18批正品白头翁样品中白头翁皂苷B4和白头翁皂苷D的含量结果如表4所示。

2.6潜在Q-Marker的抗氧化活性验证

2.6.1DPPH抗氧化活性实验 为验证谱效分析结果，同时比较潜在抗氧化标志物单一给药与配伍给药的药效差异。依据含量测定结果的比例，设置配伍组3组，白头翁皂苷B4和白头翁皂苷D比例分别为6∶1、10∶1和14∶1。结果如图5-A、B所示，白头翁皂苷B4和白头翁皂苷D均具有一定的抗氧化活性，且呈现剂量相关性。图5-C表现出不同比例配伍（6∶1、10∶1和14∶1）均比白头翁皂苷B4和白头翁皂苷D单一成分的DPPH抗氧化活性强，且存在极显著性差异（P＜0.001）。说明白头翁皂苷B4和白头翁皂苷D可能协同发挥了抗氧化作用，进一步证明二者能够作为潜在抗氧化活性Q-Marker。

2.6.2LPS诱导的RAW264.7细胞的氧化损伤实验

（1）细胞培养：RAW264.7细胞使用含10%胎牛血清高糖DMEM培养基，于37 ℃、含5%CO2条件下培养，定期换液、传代，取对数生长期细胞进行实验。

（2）NO浓度测定：将细胞以1×105个/mL的浓度接种于96孔板中，培养24 h后弃去旧培养基。将细胞分为对照组、模型组、B4组（含3、10、28 μg/mL白头翁皂苷B4）、D组（含0.5、1、2 μg/mL 白头翁皂苷D）、B4＋D组（按前述含量范围设置6∶1、10∶1、14∶1组）。细胞分组给药培养24 h后，以1 500 r/min离心10 min后，收集上清液，按照试剂盒说明书测定。图6-A结果显示，与对照组相比，LPS诱导的RAW264.7细胞氧化应激损伤模型中NO含量显著升高（P＜0.001）；与模型组相比，除白头翁皂苷B4高剂量组外（P＜0.05），白头翁皂苷B4和D各剂量组均能极显著地降NO含量（P＜0.001）；如图6-B所示，各配伍组均能显著降低氧化应激损伤模型中NO含量（P＜0.001），且白头翁皂苷B4和D（14∶1）配伍组显著优于单一成分白头翁皂苷B4高剂量组（P＜0.001）。

（3）ROS活性检测：将细胞以5×105/mL的密度接种于6孔板中培养24 h后弃去培养液，分组同“2.6.2（2）”，给药培养24 h后弃去培养液。按试剂盒说明加入探针，37 ℃孵育30 min，洗涤细胞3次后，荧光显微镜观察拍照。图6-C、E结果所示，与对照组相比，LPS诱导的RAW264.7细胞氧化应激损伤模型中ROS荧光量显著升高（P＜0.001），白头翁皂苷B4和D各剂量组均能显著降低该模型中ROS荧光量（P＜0.001），白头翁皂苷D高、中剂量组显著优于低剂量组（P＜0.001）。如图6-D、E结果所示，各比例配伍组均能显著降低氧化应激损伤模型中ROS荧光量（P＜0.001），且白头翁皂苷B4和白头翁皂苷D（6∶1）配伍组显著优于单一成分白头翁皂苷B4和D的低剂量组（P＜0.01、0.001）。

3讨论

由于历史变迁、用药习惯、野生资源不足等因素，导致白头翁存在“同名异物”、质量参差不齐的问题，用药有效与安全难以保障。除生药学鉴定外，目前高通量测序、ITS2条形码、PCR-RFLP等方法也常用于白头翁的真伪鉴别[19-20]。中药指纹图谱可用于真伪鉴别，结合药效作用，建立谱效关系，能反映符合有效性的中药整体质量[18, 21-23]。故本研究采用HPLC指纹图谱区分正品白头翁及其混伪品，以UPLC-QTOF-MS/MS技术表征正品白头翁化学成分。运用GRA、PCA、PLS 3种模式识别方法，建立正品白头翁HPLC指纹图谱和抗氧化活性间的谱效关系[14]，结合体外验证实验，准确辨识潜在抗氧化Q-Marker，评估潜在Q-Marker的生物效应。系统构建评价白头翁质量的方法，为混伪品多、有效成分含量较低、难于质控的中药材的品质评价提供参考。

白头翁传统应用中具有清热解毒、凉血、明目、燥湿、杀虫的功效，以上功效多与抗氧化作用关系密切[24-27]。本研究发现各组正品白头翁均有良好的抗氧化能力，初步辨识的抗氧化Q-Marker——白头翁皂苷B4和白头翁皂苷D能够抑制RAW264.7细胞中NO的释放，较好地清除ROS，二者以组分配伍形式存在时不同程度地优于单一成分组；DPPH自由基清除实验也表明二者均有较好的抗氧化能力，呈明显的量效关系，且二者以组分配伍形式存在时亦优于单一成分组。说明白头翁皂苷B4和白头翁皂苷D能够共同作为白头翁的潜在抗氧化Q-Marker应用于白头翁的质量控制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：徐蓓蕾，张东琦，杨娜娜，胡 扬，刘晶晶，王 昊，王金宏，李 钧，杨雪晶，孙文斌，李文兰．基于指纹图谱与谱效关系的白头翁潜在抗氧化质量标志物（Q-Marker）分析 [J]. 中草药, 2025, 56(12): 4427-4435

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