Nature | 牟泽鹏等开发基于384孔板的单细胞多组学测序技术CRAFTseq

过去20年，全基因组关联分析发现了数千个与人类复杂疾病相关的遗传位点，但如何确定真正的致病变异及其功能机制仍然是基因组学面临的重大挑战。

统计遗传学方法如共定位分析 (COLOC)、TWAS和孟德尔随机化 (MR) 通过整合表达数量性状位点（eQTL）和GWAS结果挖掘潜在的下游基因，但eQTL只能解释15-30%的GWAS位点，而且当前大规模eQTL研究仅基于计算方法而缺乏实验验证。

CRISPR敲除实验是研究基因功能的利器，但在研究非编码变异时仍存在局限性，由于编辑效率低且不均一、非编码变异效应微弱，通过bulk测序难以准确评估编辑效果。Perturb-seq等方法实现了单细胞分辨率，但通常使用CRISPRa/i系统扰动调控元件，无法实现单碱基精准编辑，而且通过捕获细胞内的sgRNA来标记编辑细胞，无法区分真正编辑与未编辑的细胞，可能在分析中产生假阳性结果。目前大部分CRISPR编辑方法依赖慢病毒感染，无法有效应用于人类原代免疫细胞。

为解决上述挑战， 2025年7月23日，哈佛医学院Soumya Raychaudhuri实验室在Nature杂志发表了 文章Precisely defining disease variant effects in CRISPR-edited single cells，研究人员开发了基于384孔板的单细胞多组学测序技术CRAFTseq。CRAFTseq结合使用mRNA转染的CRISPR编辑方法，能够在单细胞水平同时检测基因组DNA扩增子、3’端转录组和膜表面蛋白表达。该技术通过直接基因组DNA扩增子测序来确认CRISPR编辑结果，能够有效控制非特异效应，精确识别基因型引起的下游特异性变化。

为了验证CRAFTseq的准确性和可靠性，作者首先进行了细胞系混合实验，将具有已知PTEN基因突变的Jurkat细胞系与正常的Daudi细胞系按不同比例混合，成功检测出Jurkat基因组中的PTEN突变，并观察到极低的交叉污染，证明了CRAFTseq在单细胞水平基因分型的精确性。

接下来，研究团队使用单碱基编辑器验证了RPL8 eQTL在B细胞中的效应，证明了CRAFTseq能直接分辨未编辑，杂合和纯合编辑的基因型。仅用数百个细胞，CRAFTseq就能够验证微弱的非编码eQTL效应，拥有极高的灵敏度。相反，通过深度bulk RNA-seq，作者并没有发现RPL8 eQTL引起RPL8的差异表达，反而发现了一系列非特异的基因差异表达，这些差异表达基因可能是编辑过程中环境因素引起的非特异效应。

在人类原代CD4 T细胞中， 作者研究了与I型糖尿病、哮喘等自身免疫病相关的非编码GWAS位点rs61839660。CRAFTseq发现该变异具有细胞亚型特异性：它仅在分化的Treg中调控IL2RA表达，而在Th1细胞中无效应，表明CRAFTseq可用于研究细胞亚型特异的基因表达调控。

最后，为了展示CRAFTseq精确的单细胞基因分型能力，作者进行了多重编辑实验。他们同时编辑了PAX5转录因子DNA结合域的N端和C端两个区域，发现编辑区域内不同氨基酸残基突变对下游基因有不同程度的影响，其中同义突变完全不影响任何下游基因表达。这些结果进一步展示了CRAFTseq精准区分多个临近编辑位点的能力。作者还发现PAX5 DNA结合域两端存在协同效应，为理解PAX5及其家族的转录因子功能提供了新思路。

综上所述，CRAFTseq方法能够精准检测CRISPR RNP、基因敲除、单碱基编辑器等各种基因编辑结果对下游转录组和膜表面蛋白的效应。CRAFTseq的单细胞层面基因分型能力能够更加精确地解析CRISPR RNP和Prime editing的异质性、单碱基编辑器的伴随（by-stander）编辑、多位点同时编辑等复杂编辑结果。未来，CRAFTseq可广泛应用于验证eQTL、pQTL等在具体细胞类型中的效应，以及疾病相关GWAS位点的生物学机制。

Soumya Raychaudhuri 博士、 Yuriy Baglaenko 博士为本论文共同通讯作者。 Yuriy Baglaenko 博士和 Zepeng Mu （牟泽鹏）博士为共同第一作者。研究工作得到了 David R. Liu 和 Gregory A. Newby 实验室的大力支持。 Raychaudhuri 实验室隶属麻总百瀚（ MGB ）布莱根妇女医院（ BWH ）、布罗德研究所（ Broad Institute ）以及哈佛医学院（ HMS ），长期致力于类风湿性关节炎（ RA ）的临床和免疫基因组学研究。实验室相继发表了大规模的 RA GWAS 结果，开发了 Harmony 、 Symphony 、 sc-PME 等一系列针对 sc-RNAseq 分析和单细胞 QTL 的常用计算方法。 CRAFTseq 与已有计算生物学方法互补，将进一步助力解析非编码 GWAS 位点的生物学功能。

https://www.nature.com/articles/s41586-025-09313-3

制版人： 十一

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