江南大学团队工程化改造毕赤酵母，实现甲醇到法尼烯的高效转化

α-法尼烯是一种珍贵的倍半萜化合物，广泛应用于化妆品、生物燃料和制药领域。然而传统 α-法尼烯的制备主要依赖植物提取和石油化工，不仅效率低、成本高，还伴随较大碳排放。微生物发酵虽更环保，但常用底物为葡萄糖、蔗糖等粮食资源，成本高昂。

面对这一合成难题，近日，江南大学陈修来研究团队在 Systems Microbiology and Biomanufacturing 期刊发表了一篇题为“Evolutionary engineering of Pichia pastoris for α-farnesene biosynthesis from methanol”的研究论文，该研究团队选择了更可持续的碳源——甲醇，并首次系统性构建了以甲醇为唯一碳源的毕赤酵母工程菌，实现了从甲醇到 α-法尼烯的高效生物合成，最终在发酵反应器中达到产量 3.28g/L，为以非粮碳源制造高值萜类化合物提供了全新解决路径。

为了实现甲醇向高值化合物的高效转化，研究团队首先选择了天然具备甲醇代谢能力的毕赤酵母（Pichia pastoris）作为底盘菌株，并开展了一系列代谢工程优化。

在对毕赤酵母野生型 X-33 菌株的初步代谢通量评估中，研究人员发现其内源性甲羟戊酸（MVA）通路活性极低，难以满足 α-法尼烯合成所需的前体供应。

针对这一瓶颈，团队设计了三阶段代谢工程策略：在第一阶段，他们从多个植物来源筛选 α-法尼烯合酶基因，最终选定苹果来源的 MdDFS 作为最优元件，并与内源 ERG20 基因（编码法尼基焦磷酸合酶）通过基因融合构建双功能表达模块，引入基础工程菌株中，从而建立了 α-法尼烯的初始合成路径，工程菌株产量初步达到 87.3 mg/L；在第二阶段，基于代谢流分析结果，研究人员重点增强了 MVA 通路的上游部分，通过过表达关键酶 ERG10、ERG13 和截短型 HMG-CoA 还原酶（tHMG1），从而进一步提升关键前体中间体的合成速率，使 α-法尼烯产量提高至 148.3 mg/L；在第三阶段，团队则聚焦下游合成路径，通过 CRISPR-Cas9 技术将 ERG12、ERG8、ERG19 和 IDI1 的额外拷贝整合至基因组中，同时优化其表达强度，最终构建出产量达 172.1 mg/L 的稳定高产菌株。

通过该三阶段工程策略，研究团队系统性的增强了甲醇到目标产物的整体转化效率，为后续优化打下了基础。

然而，研究人员发现，当甲醇浓度超过 30g/L 时，高浓度甲醇会对微生物细胞造成强抑制性，造成菌株生长和产量的急剧下降。

为此，团队采用了适应性实验室进化（ALE）技术，即让菌株在逐步提高的甲醇浓度下（从 30g/L 到 50g/L）连续传代。最终经过 640 小时的“自然选择”，获得的进化菌株 P.pastoris evol3-4 展现出惊人的甲醇耐受性——该菌株在 50g/L 甲醇中，其生物量比原始菌株高 7.35 倍，甲醛积累量增加 634%，α-法尼烯产量提升 27.2%。组学分析显示，进化菌株可通过重编程代谢流和增强 DNA 修复能力，有效缓解甲醇毒性。

为了进一步提升产量，团队又利用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术，对进化菌株进行全基因组随机突变，并通过 96 孔板和 24 孔板的两轮筛选，从 480 个突变体中选出了最优菌株 P.pastoris ceg3-8，其 α-法尼烯产量达到 449.4 mg/L，较进化前菌株翻了一倍。

最终，在 5L 生物反应器中，研究者采用补料分批发酵策略控制甲醇浓度（维持在 0.5-2 g/L），并引入十二烷作为萃取相以减少产物积累对细胞的毒性，多种策略优化后，工程菌菌株的 α-法尼烯产量飙升至 3.28 g/L，生成速率达到 22.8 mg/L/h，成功实现了甲醇到 α-法尼烯的高效转换。

总之，该研究利用代谢通路优化、实验室进化强化耐性和全基因组诱变筛选等多种策略，构建了一个适用于甲醇底物的高效“微生物工厂”，实现了 α-法尼烯的高效合成，这一方法不仅可用于倍半萜类产品，还可延展至单萜、二萜、甚至类固醇、烯烃类平台化学品，为未来“非粮生物制造”打下基础。

参考文献：

1. Gu, Z., Chai, T. & Chen, X. Evolutionary engineering of Pichia pastoris for α-farnesene biosynthesis from methanol. Syst Microbiol and Biomanuf 5, 1039–1049 (2025). https://doi.org/10.1007/s43393-025-00372-1

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