《通讯生物学》：优化CRISPR和抗病毒疗法或可更有效清除艾滋病毒

红枫湾APP：此前有研究通过在人源化小鼠中联合使用CRISPR-Cas9编辑技术和长效抗逆转录病毒疗法（LA-ART），实现了HIV-1的部分清除。在此基础上，内布拉斯加大学医学中心的一团队开展了进一步研究——为何有过半数小鼠仍会出现病毒反弹？结果发现，导致病毒持续存在的主要原因并非CRISPR诱导的突变，而是ART药物的耐药性。

本研究由Chen Zhang和Prasanta K. Dash领导，于2025年7月19日发表在《通讯生物学》上。

2023年，该团队发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上的一项前期研究表明，同时使用CRISPR靶向HIV-1的LTR-gag区域和宿主CCR5辅助受体，并结合配合LA-ART，可在部分小鼠体内切除整合的前病毒DNA，实现病毒清除。然而，仍有一部分小鼠出现病毒持续和反弹。

因此，在本研究中，研究团队对反弹病毒的遗传特征进行了深入分析，结果未观察到与CRISPR相关的重大特异性突变。分子病毒特征表明，HIV-1是通过加速对ART药物的耐药性实现逃逸的，而非CRISPR诱导的突变。

在本研究中，人源化小鼠分别感染了HIV-1_NL4-3或HIV-1_ADA，并被分为四组：未治疗组、仅LA-ART治疗组、仅CRISPR-Cas9治疗组，以及先LA-ART后CRISPR治疗组（见图1）。

LA-ART包含纳米制剂形式的多替拉韦（DTG）、拉米夫定、阿巴卡韦和利匹韦林。CRISPR-Cas9通过AAV9载体递送，靶向HIV-1的LTR-gag区域。

研究人员在多个阶段（治疗前、LA-ART治疗后和研究终点）采集血浆病毒RNA，并使用Sanger和高灵敏度的二代测序（NGS）对gag、pol和env区域进行测序。

结果显示，所有治疗组均出现明显的病毒进化，其中env基因的突变率最高（见图2）。反弹病毒在逆转录酶（如M41L、V75I）、整合酶（R263K、V151I）和蛋白酶（I54T、F53L）区域表现出多种药物耐药性相关的突变（DRAMs），尤其是在LA-ART治疗及LA-ART联合CRISPR治疗的动物中更为突出。而在未治疗和仅CRISPR治疗的动物中未出现。

值得注意的是，在CRISPR靶点（gag 区域）及附近，未发现插入缺失或替换，且经CRISPR治疗的反弹病毒也未出现编辑诱导的逃逸迹象。纵向分析进一步证实，大多数耐药突变出现在ART阶段，而非在CRISPR暴露后出现。

研究还发现，在pol基因，特别是逆转录酶区域，出现了一些尚未在耐药数据库中记录的新突变，包括LA-ART和联合治疗组共有的E29G和Q151R替换，可能代表药物压力下的适应性改变。

有趣的是，仅LA-ART治疗的样本显示出更广泛的高频新突变，而双重治疗的反弹病毒中此类变化较少，这表明CRISPR可能对病毒多样性具有限制作用。在五份双重治疗样本中，有两份在env的CD4结合环中出现了非同义替换，可能影响宿主细胞结合亲和力；不过，其功能影响尚需进一步研究。

研究人员表示，数据表明，在双重治疗的hu-小鼠中，CRISPR切除对这些反弹HIV-1突变体的产生作用有限。

这些发现表明，在该模型中，病毒反弹主要是由ART诱导的耐药变异体的选择驱动的。另一方面，CRISPR-Cas9几乎不会产生脱靶压力，也不会导致逃逸突变的出现。CRISPR的高特异性得到了靶点处无突变以及反弹样本中高度保守的gag区域得以保留的支持。然而，通过破坏病毒复制能力，可能会产生间接选择效应，导致pol和env等未靶向区域发生适应性改变。根据治疗动物的突变模式，宿主限制因子如APOBEC3G也可能与之相关。

虽然CRISPR-Cas9可有效切除前病毒且不会引发耐药性，但本研究表明，在ART压力下仍可能发生病毒逃逸。这些结果强调了优化联合策略以抑制具有复制能力的变异体并解决潜伏病毒库的必要性。

本研究还验证了下一代测序（NGS）在检测低频DRAMs方面的应用，这些突变常被标准测序方法遗漏，而在临床环境中预测反弹风险可能至关重要。