CHO 细胞瞬转潜能再突破！Trans CHO Kit Pro：蛋白产量与品质同步跃升

在生物制药领域，CHO（中国仓鼠卵巢）细胞因其高效表达重组蛋白的能力，已成为业界首选的宿主细胞。尤其在药物研发的早期阶段，CHO细胞瞬时转染技术以其快速、灵活的优势，为候选药物的筛选和早期生产提供了强大支持。然而，传统的CHO细胞培养过程中，L-谷氨酰胺作为关键营养物质，其不稳定性常常成为制约细胞生长和蛋白表达的瓶颈。L-谷氨酰胺在水溶液中易降解产生有毒的氨，不仅影响细胞活力，更可能损害重组蛋白的质量。今天，我们将深入探讨长效谷氨酰胺如何克服这些挑战，为CHO细胞瞬转培养带来革命性的提升。

L-谷氨酰胺的困境：不稳定性与氨毒性

L-谷氨酰胺是细胞生长和代谢不可或缺的氨基酸，它为细胞提供能量，并参与核苷酸和蛋白质的合成。然而，传统的L-谷氨酰胺在水溶液中，尤其是在37°C的培养条件下，极易发生水解，生成对细胞有害的氨和吡咯烷酮羧酸。氨的积累会对CHO细胞产生多重负面影响：

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抑制细胞生长：高浓度的氨会抑制细胞增殖，降低细胞活力，甚至导致细胞死亡。

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影响蛋白质糖基化：氨会干扰蛋白质的正确糖基化修饰，从而影响重组蛋白的活性、稳定性和免疫原性。

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改变培养基pH值：氨的生成会使培养基pH值升高，偏离细胞生长的最佳范围，进一步影响细胞健康和生产力。

这些问题在瞬时转染培养中尤为突出，因为瞬时转染通常需要高细胞密度和较短的培养周期，对培养基的稳定性要求更高。

长效谷氨酰胺：CHO细胞培养的革新者

为了解决L-谷氨酰胺的不稳定性问题，科学家们开发了长效谷氨酰胺，其中最常见的形式是二肽类谷氨酰胺，例如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（AlaGln）。这种形式的谷氨酰胺通过肽键连接，在培养基中具有更高的稳定性，不易自发降解。细胞通过酶解作用逐步释放出L-谷氨酰胺和L-丙氨酸，从而实现谷氨酰胺的持续、稳定供应。长效谷氨酰胺的引入为CHO细胞瞬转培养带来了显著优势：

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显著提高稳定性，减少氨积累：AlaGln在培养基中不易降解，从而大大减少了有毒氨的产生。低氨环境为CHO细胞提供了更健康的生长条件，降低了细胞毒性，并有助于维持培养基pH值的稳定。

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持续供应营养，支持高密度培养：细胞可以根据自身需求缓慢水解二肽，确保谷氨酰胺的持续供应，避免了传统L-谷氨酰胺快速耗尽的问题。这使得CHO细胞能够在高密度培养条件下保持旺盛的生长和代谢活性，从而提高瞬时转染的蛋白质产量。

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改善重组蛋白质量：氨积累的减少有助于维持正常的蛋白质糖基化途径，从而可能改善重组蛋白的结构完整性、生物活性和批次间的一致性。

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简化操作流程：由于长效谷氨酰胺的稳定性，可以减少培养基中谷氨酰胺的添加频率，简化培养基配制和补料操作，提高实验效率。

文献解读

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（AlaGln）在细胞培养基中的增效作用：基于抗CD20嵌合抗体生产的POTELLIGENT™ CHO细胞系研究

一、AlaGln对单克隆抗体滴度的提升作用

在CHO细胞培养中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（AlaGln）作为谷氨酰胺（Gln）的稳定二肽形式，可显著提高抗体产量。文献中通过对比三种培养条件（Gln-Gln、Gln-AlaGln、AlaGln-AlaGln）发现，完全以AlaGln替代Gln时，抗体滴度达到最高值（478 mg/L），较传统Gln-Gln组（246 mg/L）提升94%（图1）。这一现象与二肽的缓释特性相关：AlaGln在培养基中降解速率仅为Gln的1/5，通过持续供应Gln维持核苷酸合成和能量代谢（TCA循环），从而延长高产期。

图1 细胞培养结束时单克隆抗体滴度的比较。

研究还发现，在CHO细胞培养中，使用AlaGln完全替代谷氨酰胺不仅可以最大化单克隆抗体滴度，还能显著减少细胞凋亡和氨的产生。这为长效谷氨酰胺在提高CHO细胞生产力方面的应用提供了有力证据。

二、抑制细胞凋亡的机制验证

AlaGln的稳定性直接降低了细胞凋亡率。通过流式细胞术检测发现，培养第8天时，AlaGln-AlaGln组的早期凋亡细胞比例最低（图2），而Gln-Gln组因氨积累导致凋亡率显著升高。进一步分析表明，Gln在37℃下自发降解产生的氨（NH₄⁺）浓度随时间线性上升（图3），而AlaGln组的氨生成量减少70%。当培养基中氨浓度>20 mmol/L时，CHO细胞生长抑制率超过50%（图4），证实氨毒性是凋亡的主要诱因。

图2 早期凋亡比率的比较:Gln–Gln (黑色)、Gln-AlaGln (阴影)和AlaGln–AlaGln (垂直)

图3 12 mmol/L Gln(黑色圆圈)和12 mmol/L AlaGln(黑色方块)的培养基中氨随时间的变化

图4 第0天和第4天之间的比生长速率。

三、工业化生产的适配性优势

在1L生物反应器规模中，AlaGln的效益更为突出。12C-5细胞系在AlaGln-AlaGln条件下抗体滴度达341 mg/L，是Gln-Gln组的2倍（图5）。这种差异源于二肽的工艺兼容性：

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储存稳定性：AlaGln在培养基预存阶段几乎无氨积累（图3），适合大规模储罐投料；

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动态代谢调控：细胞通过胞外肽酶逐步水解AlaGln释放Gln，避免营养突释，维持碳氮平衡；

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克隆普适性：不同CHO克隆（如1A7-15与12C-5）均呈现产量提升，但幅度依赖细胞系代谢特性。

图5 细胞培养结束时单克隆抗体滴度的比较

通过in silico指导的通量分析探究二肽补料培养基对 CHO 细胞培养的代谢影响

一、甘氨酰-L-酪氨酸（GY）二肽的缓释特性与长效机制的关联

本研究通过GY二肽的浓度梯度实验（0.125×–2.0×）发现缓释效应：GY在细胞内水解后逐步释放酪氨酸，避免游离氨基酸的瞬时浓度冲击。该特性与长效谷氨酰胺二肽（如AlaGln）的缓释机制一致，均通过稳定氮源供应减少代谢波动。

二、GY与长效谷氨酰胺通过相似机制优化氮代谢

直接氨抑制：0.5× GY实验组的氨积累降低30%，与长效谷氨酰胺减少谷氨酰胺降解的效果相当。基础培养基Gln降至2mM后，氨水平进一步下降，滴度提升8.96%（图6）。

图6 含0.5×GY的补料培养基中，谷氨酰胺（Gln）补料减量及天冬酰胺（Asn）或精氨酸（Arg）减量的验证实验数据曲线

三、研究揭示二肽应用的通用原则

研究表明，二肽在CHO细胞培养中的应用遵循两个关键原则：首先，存在明确的浓度阈值效应，实验数据显示0.5× GY二肽浓度能够实现最佳培养效果，浓度过高反而会增加代谢负担，这一现象与长效谷氨酰胺需要精确控制水解速率的优化策略相呼应；其次，二肽需要与关键游离氨基酸形成协同调控网络，GY实验组中谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn）下调带来的增效作用（图6）证实，二肽必须与游离氨基酸（如Gln）进行联动调控，才能系统性降低细胞代谢压力，这一发现为优化细胞培养工艺提供了重要理论依据。

这些研究成果共同揭示了长效谷氨酰胺在CHO细胞培养中不可替代的优势，为生物制药的研发和生产提供了新的策略和工具。

健顺生物明星产品：Trans CHO Kit Pro

健顺生物的Trans CHO Kit Pro 表达系统包含升级款基础培养基Trans CHO（Basal Medium）与补料培养基 ALLY Feed 100（Feed Medium）为完全化学成分界定（Chemically Defined）培养基，均不含血清、水解物及任何动物来源的成分。

其中升级款基础培养基Trans CHO（Basal Medium）已经对长效谷氨酰胺的含量进行优化，这几个组分进行了协同作用，从而最大程度的提高了蛋白表达的产量。

产品优势

通用性强，操作流程简洁

适用于 CHO-K1、ExpiCHO、CHO-S等多种 CHO 细胞，具备良好通用性；

操作简便，无需细胞驯化或孵育步骤，缩短研发周期并减少操作；

可兼容自动化工作站，实现高通量瞬转表达和蛋白筛选。

高效表达，性能卓越

高细胞密度下仍具备高转染效率、高活率及高表达量；

表达效率显著，24小时产量突破100 mg/L，72小时稳定达500 mg/L。

工业化适配，支持规模化生产

支持大体积转染，线性放大一致性好；

全流程无需离心操作，有效提升效率并降低污染风险。

成本控制，经济高效

无需复杂工艺适配，整体流程优化；

具备市场领先的性价比，有效降低项目初期投入成本。

案例

Trans CHO Kit Pro能够支持抗原和抗体高效表达，对CHO-K1细胞进行转染，转染密度为6×106 cells/mL。下面是Trans CHO Kit Pro对瞬转细胞培养的实验结果展示。

图7 Trans CHO Kit Pro与对照组（PEI法）对CHO-K1细胞瞬转效果进行对比，Trans CHO Kit Pro用于CHO-K1 细胞瞬转，其转染效率明显优于PEI 转染试剂（40kd）

不同的转染方案效果对比：案例1

图8 电转 vs Trans CHO Kit Pro第7天蛋白产量对比

相同蛋白分子，相同表达时间下，使用健顺生物的Trans CHO Kit Pro 在转染后第7天蛋白表达量为电转2倍。

不同的转染方案效果对比：案例2

图9 竞品培养基，电转，Trans CHO Kit Pro第5天蛋白产量对比

在不同项目中，使用Trans CHO Kit Pro进行瞬转，蛋白表达量显著高于竞品和电转，其中项目D中第5天表达量可达 2 g/L。

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[1] Imamoto, Y., Tanaka, H., Takahashi, K., Konno, Y., & Suzawa, T. (2012). Advantages of AlaGln as an additive to cell culture medium: use with anti-CD20 chimeric antibody-producing POTELLIGENT™ CHO cell lines. Cytotechnology, 65(1), 135-143. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3536879/

[2] Luo, S., Li, Y., Chen, Y., & Wang, T. (2024). Exploring metabolic effects of dipeptide feed media on CHO cell culture performance. Biotechnology and Bioengineering, 121(3), 10791731. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10791731/

关于健顺生物

健顺生物团队组建于2011年，专业从事无血清细胞培养基的研发、生产和销售，拥有强大的自主创新及研发能力。除了供应高质量的细胞培养基，健顺生物还为客户提供培养基配方开发、细胞培养工艺开发与放大、培养基配方委托生产、分析检测服务等完整解决方案。公司产品和技术服务主要应用于抗体、细胞治疗、IVD、及人/兽用疫苗行业。

作为亚洲细胞培养行业的龙头企业, 健顺生物在中国、韩国、美国等地均有研发实验室或生产基地，具备大规模商业化培养基的稳定供应链实力，年产能达千吨级。健顺生物自主研发超百款商业化细胞培养基，部分培养基凭借卓越的性能已成功应用于超过40个上市产品。健顺生物细胞培养基生产基地已通过ISO13485、ISO14001、ISO9001、ISO45001、HALAL等认证及一类医疗器械生产备案，建立了与国际细胞培养基生产公司一致的质量管理体系。