Plant Journal | 大连理工大学利用微藻光合自养高效合成高价值倍半萜并环萜烯

近日 ，大连理工大学生物工程学院智能生物制造教育部重点实验室孔凡涛副教授 研究团队 在ThePlantJournal上发表了题为Efficient photoproduction of a high-value sesquiterpenepentalenenefrom the green microalgaChlamydomonasreinhardtii的研究论文 。该研究 在莱茵衣藻中建立了光合合成 可用于 航空燃料前体 并具有药用价值 的 并环 萜烯 ( pentalenene ) 的工程体系，通过强化 MEP 途径和优化前体供应 的细胞工厂中 产量 并环萜烯 从 0.28 mg/L 提升至 13.65 mg/L， 是目前已报道的利用光合自养真核微生物细胞工厂生产 倍半萜 的最高 产量。

并环萜烯 是一种在多链霉菌属 ( Streptomyces ) 的提取物中被发现的倍半萜类抗生素代谢物。作为一种3环不饱和倍半萜烯，它具有低凝固点、高能量密度、高体积燃烧净热值等优异的燃料特性，是一种可以被开发为先进的生物燃料。 微藻可以 通过光合作用将 CO ₂ 转化为高能量产物，是可持续合成萜类化合物的理想平台。然而，光合微生物中天然 无法 合成 并环萜烯 合。 针对上述问题，本研究首次在 真核 微藻 — 莱茵衣藻中建立了 合成 并环萜 烯 的完整 途径， 突破 了微藻天 然 无法 合成并环萜 烯的限制，提出了一种强可持续性的绿色生物制造策略。

过表达 penA 实现 莱茵 衣藻生产并环 萜烯

为 了 实现在 莱茵 衣藻并环 萜烯 的生物合成 ，研究者首先将链霉菌来源 的并环萜烯 合酶基因 penA 按 照 莱茵衣藻密码子 偏好进行优化，并串联插入 RBCS2 第一内含子及 mVenus 荧光报告基因，构建成由 Hsp70A-RbcS2 双启动子驱动的核表达载体 pOpt_mVenus_Paro-penA ；随后通过电穿孔将该线性化质粒导入 UVM4 宿主，利用 15 mg L ⁻ ¹ 巴龙霉素筛选获得抗性克隆。

为了验证 penA 基因的表达，研究人员使用 菌落 PCR、RT-PCR 与 Western blot 进行验证。 并在 培养时 用 5 % 十二 烷 覆盖液面 以萃取产物， 最终 GC-MS 仅在 penA 阳性藻株中检测到与标准品一致 的 并环萜烯 峰 ， 从而首次 证明 了过表达单一 penA 即可驱动莱茵 衣藻将 CO ₂ 与 光合碳流转化为并环萜烯 。

代谢途径改造 提高工程 藻株并环萜烯 含量

莱茵衣藻虽能 通过内源MEP途径生成IPP/DMAPP，但流向倍半萜 的碳流 受DXS（限速酶）和HDR（末端还原酶）活性不足以及IPP∶DMAPP比例失衡的双重 制约 ， 导致 并环萜 烯 产量较低。为此，研究者首先构建了 pHyg -DXS-HDR载体；将其 导入 penA 表达株 。随后，再将携带 Ble -IDI融合基因的质粒导入上述 藻株 ，利用三抗（巴龙霉素+潮霉素+ 博来霉素 ）筛选 获得工程藻株 。 RT-qPCR显示 ， 目标工程藻株中， IDI表达量上调8倍；IDI催化IPP ↔ DMAPP快速互变，缓解底物抑制并提升FPP通量，最终使 pentalenene 产量 达2.86 mg L ⁻ ¹ 。进一步研究发现， 250 mL柱式 光生物反应器 中，兼养 培养下 产量达 到 13.65 mg L ⁻ ¹ ，产率可达 1.92 mg L ⁻ ¹ day ⁻ ¹ ；自养培养条件下产量达到3.7 mg L ⁻ ¹ ，产率 可达 336.3 μ g /L/day 。

代谢物分析表明，MEP途径中间体（DXP、MEP、ME- cPP ）及前体物质3-磷酸甘油醛（G3P）和法尼基二磷酸（FPP）水平的提升 是并环萜烯 高产的关键因素。值得注意的是，工程藻株的细胞生长和光合活性与未转化藻株无明显变化。本研究成果不仅丰富和深化了倍半萜生物合成领域的理论基础，也为构建基于光合微生物的细胞代谢工程提供了重要的理论依据。

并环萜烯 合成 对 工程藻株 细胞 生理 的影响

基因改造后， 莱茵衣藻的 宏观生长几乎并未受到影响：叶绿素含量、PS Ⅱ最大 光化学效率（ Fv / Fm ）和细胞直径与野生型持平，说明光 合系统 保持完整。然而，能量代谢流动却发生了显著重排——结果显示，改造株的淀粉含量下降约30%，显示碳骨架被优先导向MEP途径；同时类胡萝卜素水平在DXS/HDR/IDI 叠加株中升高 20%，反映上游萜类前体供应增强。干重在仅表达 penA 的菌株略降，但在MEP 强化株中恢复 ，表明能量与还原力的再分配已达新稳态。总体上，工程藻株以轻微牺牲储能物质为代价，换取高效且持续的光合萜类输出，为工业化生产提供了“高产而不减产”的理想表型。

综上，该 研究 将链霉菌来源的 pentalenene 合酶 penA 导入藻细胞，使原本不能产 萜 的 衣藻获得 新功能；接着通过多基因叠加策略，先后过表达MEP途径限速酶DXS、HDR及异构酶IDI，打通碳流、平衡前体，使产量由初始281 μg/L提升至2.86 mg/L，增幅达10.2倍。 代谢组 学揭示，法尼基焦磷酸（FPP）的 富集是高产的关键瓶颈。放大培养显示，在柱式光生物反应器并补加醋酸的混养条件下，终点滴度可达13.65 mg/L， 创微藻 倍半萜产量新高，而细胞生长、光合效率与野生型无异，且通过十二烷覆盖实现产物原位高效提取。该工作不仅首次实现非植物源倍半萜在光合底盘中的高效合成，也为 利用微藻规模化 生产可持续航空燃料提供了 新 的工程范式。

论文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.70354