鹦鹉雌雄难辨？一“羽”道破天机

作者：程松

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导语

本研究成功实现了仅凭一根羽毛即可精准判别鹦鹉性别，为解决鹦鹉人工繁育、濒危物种保护及进化研究中的性别鉴定瓶颈提供了强有力的技术支撑。

摘要

鹦鹉为单态性鸟, 很难通过外观和形态来进行性别鉴定，传统的性别鉴定方法不再适合单态性物种，给人工配对与繁殖造成了困难。本实验利用非伤害性取样方法，提取10只已知性别鹦鹉羽毛的基因组DNA，然后通过引物Sex F/Sex R的对其CHD基片段进行扩增，Sex F/Sex R的PCR产物大小分别是650bp与500bp，结果显示,特异性引物从雄性鹦鹉中扩增出1条片段, 从雌性鹦鹉中扩增出2条片段, 均可以对鹦鹉的性别作出了准确鉴定, 解决了鹦鹉人工繁育中的关键问题。

关键词：鹦鹉；性别鉴定；CHD基因

前言

鹦鹉属于鹦形目（Psittaciformes），有鹦鹉科和凤头鹦鹉科2个科、82个属、358个种，是当今鸟纲中最大的科之一，属于典型的攀禽，分布在世界各地的热带地区。鹦鹉以其靓丽的羽毛以及能够模仿人类语言等特点，被大多数人欣赏和爱护，因而经常被人们作为宠物饲养，而它们的野生种群也因此受到了威胁， 许多种类都已经成为濒危物种。鹦鹉是一种单态性鸟，即雌雄同型，它们的性别鉴定很难通过外观以及其他行为进行判断区别，这给配对造成了很大的困难。在动物园或鹦鹉养殖场中，如果可以通过鉴定雏鸟的性别，就能淘汰非目的的性别个体，也能降低饲养成本，提高经济效益，并且在人工饲养管理、有效的繁殖、遗传研究与疾病防治等方面有重要的意义，尤其是对如今一些濒危的珍稀鸟类的保护与管理具有重要的意义。

目前，可用于鉴定单态性鸟或双态性幼鸟性别的传统方法有：目测性器官；通过组织培养进行染色体分析；测定粪便中雌激素与睾酮比例；对性腺进行直接造影的内窥镜及超声波检查；体尺测量法；用录音机录下鸣叫声比较声波频率等；这些方法的性别鉴定，耗体力、可靠性差、且鉴定结果误差大。鸟类的性染色体为ZW型，ZZ为雄性，ZW为雌性。随着近年来，分子生物学的高速发展，分子鉴定鸟类的性别的措施也趋于盛行。其实验过程较于传统方法更简便、其实验结果比传统方法也更准确、实验材料的采集也更简单方便。尤其是对于濒危野生动物，非损伤采样法的运用更主流化[1]。分子性别鉴定是目前比较广泛使用的方法。对于非平胸鸟类，应用最多的是CHD基因，染色体螺旋蛋白基因（chromobox-helicase-DNA binding gene），

CHD基因十分保守，并且有两个同源拷贝CHD-W和CHD-Z。其中CHD-W是关于W连锁，

CHD-Z是关于Z连锁[2-3]。雌性个体中具有两个同源拷贝 CHD-W和 CHD-Z ，而雄性个体中只有 CHD-Z。故雄性个体（ZZ）只有一个拷贝CHD-Z，只有一个条带；雌雄个体（ZW）有两个拷贝 CHD-Z、CHD-W，可显示出两个条带。因此，本研究通过对10只已知性别的鹦鹉进行性别鉴定，旨在探索一种简便且准确度高的鹦鹉的性别鉴定方法，这对于动物园与鹦鹉繁殖场的人工饲养、保护物种以及繁殖育种等至关重要。

一、材料与试剂

1.1仪器

超净工作台（苏净集团安泰空气技术有限公司）、FA1604 型电子分析天平（上海天平仪器厂）、PCR扩增仪（Bio-Rad公司）、高速冷冻离心机（美国Thermo公司）、DY-A型电泳仪（上海康达电子仪器厂）、Hema紫外透射分析仪凝胶成像系统（珠海市黑马医学仪器有限公司）、水浴锅（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）、涡旋震荡仪（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）、微波炉（佛山顺德区美的微波炉电器制造有限公司）、移液枪（德国eppendorf公司）

1.2 试剂

Forensic DNA Kit提取试剂盒、Mix均购自于OMEGA公司，核酸染料GoodView、DNA Marker DL2000、琼脂糖、50X TAE电泳缓冲液购自Invitrogen公司、无水乙醇购自深圳市东茂化学试剂有限公司

1.3 材料

11只鹦鹉的羽毛由广州某宠物医院提供，均已通过繁殖证实性别，编号分别为 HP01、 HP02、HP03、HP04、MD05、MD06、MD07、MD08、XF09与XF10，进行DNA抽提，保存在﹣20℃备用。

二、实验方法

2.1引物的设计与合成

根据Genbank已公布的CHD的基因组序列，利用分子生物学软件设计了1对CHD基因的引物，为Sex F/Sex R，Sex F/Sex R目的片段大小为650bp与500bp，引物序列如下：

Sex F：5′- GTTACTGATTCGTCTACGAG -3′；

Sex R：5′- ATTGAAATGATCCAGGCTTG-3′；

引物由广州睿博兴科生物技术有限公司合成。

2.2 鹦鹉羽毛DNA的提取

在10个无菌的2mL的EP管的管壁标记HP01、 HP02、HP03、HP04、MD05、MD06、MD07、MD08、XF09与XF10，然后在每管加入血液50uL，加入200uL Buffer STL，60℃水浴15min，加入25uL蛋白酶K，混匀，加入225uL Buffer BL与225uL无水乙醇，混匀，然后用DNA Wash Buffer洗涤，最后用40uL预热到70℃的Elution Buffer溶解DNA，DNA保存在﹣20℃备用；具体的步骤参照OMEGA公司的Forensic DNA Kit试剂盒说明书。

2.3 PCR扩增与PCR扩增体系

PCR反应体系：

以羽毛中提取的DNA为模板，以Sex F/Sex R为引物进行PCR反应，反应体系为25ul：2×Trans Taq-TPCRSuperMix 12.5ul、模板DNA 1.0uL、Sex F 1.0uL、Sex R 1.0uL、ddH2O 9.5uL；

反应程序为：

95℃ 4mi n；94℃ 30 s ，44℃ 30 s，72℃ 50s，35个循环；72℃，10 min，PCR反应结束后，将PCR产物放入4℃保存。

2.4 琼脂糖凝胶电泳

取8uL的PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，120V，20min结束后，用Hema紫外透射分析仪凝胶成像系统检测扩增结果，拍照记录，使用DNA Marker DL2000进行标记。

三、实验结果

3.1 CHD基因Sex F/Sex R引物对PCR扩增结果

对10份鹦鹉的羽毛样品，Sex F/Sex R引物经过PCR扩增之后，再经过电泳结果显示，雄性个体显示为一条带CHD-Z（500bp），雌性个体显示为两条带CHD-Z（500bp）、CHD-W（650bp）。与预期的目的条带相符(图1)。

M:2000bp DNA Maker；1-10:鹦鹉CHD基因PCR产物;

图1 鹦鹉CHD基因的PCR检测结果

3.2 鹦鹉性别鉴定结果

10只鹦鹉性别鉴定结果统计见表1。

表1 10只鹦鹉性别鉴定结果

四、讨论分析

鸟类的基因型为ZW型（ZZ为雄性，ZW为雌性），随着城市化与工业化的快速发展，以及不法分析的非法捕杀的影响，我们赖以生存的生态环境正在遭受到污染与破坏，导致许多珍稀鸟类正在濒临种族灭绝的危险。因此很多动物园模拟鸟类的野外生活环境，让它们有更好的栖息与繁殖的环境，提高它们的存活率与繁殖率。动物的繁殖与育种，都离不开动物的个体性别的鉴定 [4-5] 。世界上60%鸟类是单态性鸟，即雌性同型，很难在外形上、生理上以及行为上进行性别鉴定，即使对于一些雌雄异性的鸟类进行性别鉴定也很难，只有在性成熟后，雌雄在形态上才有区别，特别是对雏鸟进行性别鉴定就更难了。因此，分子生物学方法便成为鸟类性别鉴定的简便与有效的方法，早期主要是使用RAPD、荧光标记性染色体基因探针、Southen杂交几乎可以鉴定所有的鸟类 [6-7] 。

后来发展到用PCR方法扩增性染色连锁基因的特异性区段序列，CHD基因被Griffiths等 [7] 发现，其进化速率慢，在所有的非平胸鸟类中都非常保守，根据在Z/W染色体上的分布以及序列差异，从而快速简便对鸟的性别进行鉴定。Griffiths等利用P2/P8引物对鸡形目等28个种的鸟进行性别鉴定，其中只有对平胸鸟类中的鸵鸟不能做出正确的鉴定，因此该方法在非平胸目非常适用[8]。江杉等利用引物P2/P8扩增出CHD基因片段，成功鉴别鹳形目5种鹭科鸟类与1种鹮科鸟类 [9] ，袁梦利用2550F/2718R引物扩增出CHD基因片段，对鹈鹕的性别进行鉴定，并进行了常见鸟类的相应同源性序列进行聚类分析。胡锐颖等同样以2550F/2718R引物，成功的鉴定出了绿孔雀、白鹤、黑颈鹤、白头鹤、白枕鹤、东方白鹤等国家一级保护鸟类进行性别鉴定 [10] 。

目前在鸟类研究中，主要是采集换羽期的羽毛，从羽毛中提取基因组DNA。 Trefil et al证实了可以利用鸟类羽毛提取DNA。目前主要是从羽毛根部 提取基因组DNA，在拔取羽毛的过程中，该部位可能会带有部分血液或组织，因此提取物中DNA量较多，不含蛋白质和RNA等物质，在提取过程中不易发生DNA降解情况。另外，田秀华等为解决珍稀濒危鸟类分子生物学研究中存在的取样局限性问题，对大鸨羽毛的不同部位的DNA提取进行了研究。研 究发现羽毛羽根部位可以提出一定纯度的核DNA和mtDNA，这些研究拓宽了珍稀 濒危鸟类采样的范围，为珍稀濒危鸟类的分子生物学研究提供了更广阔的样品来源。本研究采集鹦鹉换羽期的次级飞羽，从羽根部位提取基因组DNA，结果发现羽根部位提取的一定纯度和浓度的DNA，能够顺利进行PCR扩增。

本研究前期利用引物对Sex F/Sex R对已知性别的鹦鹉进行实验，性别鉴定结果与已只鹦鹉的性别完全一致。目前，鹦鹉性别鉴定的分子生物学方法主要被科研机构和一些专门从事鸟类性别鉴定的商业公司应用，但是随着鹦鹉育种、濒危鹦鹉物种保护以及进化研究等方面的工作越来越受到重视，该种方法的应用范围必将逐渐扩大，并且会产生广阔的市场前景。希望这种技术将为今后鹦鹉繁殖育种、保护濒危的物种以及国际交流濒危鸟类提供可靠的技术资料，对鸟类的人工繁殖、细胞遗传学以及进化生物学的研究具有重要的意义。

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[1]田秀华，刘铸，何相宝，等.7种鹤形目鸟类性别的分子鉴定[J].动物学杂志，2006（05）：62-67.

[2]沈玮，潘少坤，罗红梅，等.基于CHD基因序列分析的帝企鹅性别鉴定研究[J].安徽农业科学，2010（03）：1167-1168.

[3]李明，丁长春，魏辅文，等.朱鹮性别鉴定相关基因及其性别鉴定[J].科学通报，2001（02）：129-131.

[4]刘铸，白素英，田秀华.CHD基因与非平胸鸟类性别鉴定[J].生物技术通报，2006（01）：147-150.

[5]LESSELLS C,VTITEMAN A.Sexing birds using random amplified polymorphic DNA(RAPD) markers [J].Molecular Ecology, 1998, 7: 187-195.

[6]OGAWA A, Molecular characterization and cytological mapping of a non-repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing Carinate birds [J]. Chromosome Research, 1997,5: 93-101.

[7]Griffiths R,Tiwari B.Sex of the last wild Spix macaw [J].Nature, 1995, 375(6531): 454.

[8]GRIFFITS R,DOUBLE M C, ORR K.et al.A DNA test to sexmost birds [J].Molecular Ecology, 1998, 7: 1071-1075.

[9]江杉，陈小麟.扩增性别鉴定基因片段的鹭类性别鉴定方法的研究[J].厦门大学学报：自然 科学版，2006,45(S1): 152-155.

[10]胡锐颖，耿昕，马君.一种简单通用的鸟类性别分子鉴定技术[J].实验生物学报，2003,36(5): 401-404.

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编 辑|张秋雁

审 核|郭羽丽