中国农科院/华中农大合作开发新一代基因编辑技术TKC2，实现无转基因基因编辑“降本增效”

植物基因编辑技术旨在对基因组进行稳定、可遗传且非嵌合的修饰，以实现优良性状的稳定遗传。然而，传统基因编辑技术中，转基因的持续存在不仅增加了评估目标表型和遗传稳定性的难度，降低了遗传分析的可预测性，还可能带来脱靶风险，甚至导致监管问题，阻碍了基因编辑作物的商业应用。因此，开发一种能够在基因编辑完成后有效去除转基因的技术，对于功能基因组学研究和作物改良具有重要意义。

近日，中国农业科学院作物科学研究所/国家南繁研究院作物精准育种技术创新团队联合华中农业大学水稻团队在Plant Biotechnology Journal上发表了题为Transgene-Killer-CRISPR version 2 (TKC2) eliminates occasional transgene escape by coupling with a RUBY reporter的研究论文，成功开发了新一代基因编辑技术——Transgene-Killer-CRISPR version 2（TKC2），实现了无转基因基因编辑“降本增效”。

Transgene-Killer-CRISPR（TKC）技术是一种能够在一代内分离出不含转基因的编辑植株的技术，但存在转基因偶尔逃逸的问题。为解决这一难题，研究人员将可视化RUBY报告基因与TKC技术相结合，开发了TKC2系统。该系统通过将RUBY与CRISPR偶联，形成inTGR-Cas9-RUBY单一基因盒，以RUBY颜色作为gRNA和Cas9表达水平的可视化指标。实验发现，RUBY在愈伤组织、根、叶和茎中均有不同程度的积累，且RUBY颜色可有效指示转基因阳性及基因编辑效果。

研究人员进一步将RUBY与四种TKC自杀盒相结合，生成RUBY-TKC（TKC2）系列载体。以SE5基因和YSA基因为靶点进行实验，结果表明，所有呈现RUBY颜色的T0代植株均为转基因植株，且RUBY植株的靶基因位点编辑效率高于绿色植株，RUBY颜色与靶基因编辑之间存在很强的相关性，可作为判定转基因突变植株的合适指标。

在T1代目标基因编辑水稻植株中，TKC2策略显著提高了转基因的消除能力。不同TKCs组合的T1代中，至少96.00%的植株不携带转基因，其中TKC2.1实现了100%的转基因清除。全基因组测序分析进一步证实，TKC2已成功从水稻基因组中清除了转基因成分。此外，该技术还可防止转基因花粉或种子释放到环境中，有效缓解了人们对转基因元件广泛传播的担忧。

图1. 利用RUBY可视化转基因从TKC中的逃逸

TKC2技术的成功开发，不仅解决了传统TKC技术中转基因偶尔逃逸的问题，还无需在T0代及后续代进行基于PCR的转基因分型，大大提高了获得无转基因基因组编辑水稻植株的效率。该技术具有广泛的适用性，可应用于其他CRISPR/Cas系统和有性繁殖作物，有望在植物遗传研究和作物遗传改良中得到广泛应用，为推动农业科技进步和保障粮食安全提供有力支撑。

华中农大已毕业博士生朱敏为论文第一作者，作科所和玉兵副教授为论文通讯作者。中国农科院团队首席夏兰琴研究员、加州大学圣地亚哥分校赵云德教授和华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室熊立仲教授为该研究做出了重要指导。该研究得到国家自然科学基金、中国农科院青年专项、南繁专项、海南崖洲湾种业实验室揭榜挂帅项目等资助。

论文链接：

http://doi.org/10.1111/pbi.70257