《食品科学》：安徽工程大学刘艳教授等：基于理性设计的碱性蛋白酶AprEbl热稳定性改造及其潜在机制分析

碱性蛋白酶因其具有优秀的酶学性质及零污染的环保属性，成为工业生产中备受青睐的酶制剂产品。目前市场上大多数蛋白酶属于中温型，其最适温度通常在20～45 ℃之间，这使得它们无法满足一些高温工业应用需求。

传统提升碱性蛋白酶热稳定性的策略为定向进化或随机诱变，不仅耗时耗力，且成功率较低。近年来许多研究者对已知碱性蛋白酶序列及其对应的热稳定性进行深入挖掘和分析，已经能够利用生信技术精准识别出与热稳定性紧密相关的关键氨基酸位点，再通过计算机技术能够实现对蛋白酶序列突变更为精准的模拟和预测。另外，目前市售的产碱性蛋白酶大部分由地衣芽孢杆菌生产，其中AprE所编码的蛋白酶占比最高。

基于此，安徽工程大学生物与食品工程学院的罗雅妮、刘艳*和安徽张恒春药业股份有限公司的胡刘秀等聚焦于利用生物信息学和计算机技术提升碱性蛋白酶AprEbl热稳定性并剖析其机制，以期为碱性蛋白酶相关产业的发展带来新的突破。本研究以实验室保藏的1 株具有较好产酶活性的地衣芽孢杆菌B66（野生菌株）为出发菌株，因其基因表达调控机制不明等原因，将目的基因AprEbl的表达菌株更换为枯草芽孢杆菌168蛋白酶E缺陷株，探究重组蛋白酶的酶学特性，再借助计算机辅助设计突变位点，构建AprEbl突变体。此外，利用分子动力学模拟（MD）技术对该突变体的蛋白质结构进行分析，探讨其稳定性提高的分子机制，以进一步了解酶的结构与功能关系，为后续酶修饰提供理论依据。

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AprEbl的序列分析及建模

经序列比对分析后发现，AprEbl与芽孢杆菌属的碱性蛋白酶序列相似性最高达89.7%。它们通常都属于S8肽酶家族，具备高度保守的催化三联体结构，由组氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）和丝氨酸（Ser）构成，且在底物结合区域拥有相似的β-折叠与α-螺旋组合排列方式（图2A）。鉴于高度相似性，选用PDB数据库中已有的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168菌株的碱性蛋白酶（Apr）晶体结构（PDB：3whi，X射线衍射分辨率为2.4 Å）作为模板，构建AprEbl的三维模型（图2B），将得到的模型提交至SAVES v6.1在线工具进行评分，最优结果用于后续的MD分析。

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AprEbl突变体的预测与筛选

如图3A所示，该蛋白的183NSIG186、265SGS267和318GTY320区域构象不稳定。再对这3 个不稳定区域的10 个氨基酸残基位点进行虚拟饱和突变，根据突变能筛选出5 个单点突变体N183W、G186I、S265H、S267F、Y320W（图3B），突变能在－0.5 kcal/mol以下为正向突变，能提升蛋白的稳定性，突变能越低提升效果越显著。

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AprEbl突变体的构建与表达

如图4所示，突变体粗酶液和纯化后的酶液在39 kDa处均有明显条带，表明突变体酶成功表达，且纯化后的条带清晰，表明获得了纯突变体。

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AprEbl及其突变体的酶活性与比活力分析

如图5A所示，不同浓度的L-酪氨酸溶液与OD680 nm呈良好线性关系，可以通过酪氨酸的生成量计算碱性蛋白酶活力。拟合后得到标准线性方程：y＝0.01x＋0.007（R2＝0.991），K为99.3 µg。如图5B所示，与野生型相比，突变体N183W、G186I、S265H、S267F、Y320W、N183W/G186I、S265H/S267F在40 ℃条件下的酶活性分别下降了22.2%、43.2%、14.7%、43.7%、58.7%、77.4%、18.7%；野生型的比活力比突变体N183W、G186I、S265H、S267F、Y320W分别高1.244、1.469、1.057、1.303、1.425 倍。但突变体S265H/S267F的比活力和野生型相比基本持平，野生型的比活力能够达到90.36 U/mg，突变体的比活力则达到了89.94 U/mg。

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单点突变体的酶学性质分析

如图6A所示，野生型与单突变体的最适pH值一致，均在pH 10.0时具有最高剩余酶活力。如图6B所示，所有突变体的最适温度较野生型都有一定程度的提升，突变体S265H的最适温度较野生型提升最大，从50 ℃上升至60 ℃，其余突变体的最适温度均为55 ℃。在高温情况下，突变体的剩余酶活力高于野生型。如图6C所示，5 个单突变体的热稳定性相较于野生型均有所提升，其中S265H的热稳定性效果最好，N183W次之，由于265与267位点相近，且都有一定提升效果，因此，设计双突变体S265H/S267F，同理，设计双突变体N183W/G186I，进一步探索其酶学性质。

06

复合突变体的酶学性质分析

将构建的复合突变体S265H/S267F、N183W/G186I在枯草芽孢杆菌BS168蛋白酶E缺陷型中进行了表达，通过活性测定发现突变体N183W/G186I表达后酶活力及比活力大幅下降，无实际意义，而复合突变体S265H/S267F的酶活力与比活力相较原始菌株无明显变化，故对其进行下一步的酶学性质研究。如图7A、B所示，S265H/S267F的最适pH值为10，与野生型一致；S265H/S267F的最适温度为65 ℃，相较于突变体S265H提升5 ℃，相较野生型提升了10 ℃。如图7C所示，在碱性环境（pH 8、9、10、11）中孵育6 h后，突变体S265H/S267F仍能保持50%以上的酶活力，在pH 10条件下孵育6 h后S265H/S267F剩余酶活力高达80%。如图7D所示，在40、45 ℃条件下孵育2.5 h后，突变体S265H/S267F的剩余酶活力仍旧在80%以上，而在75 ℃条件下也能够维持酶活力长达1.5 h。

07

突变体的热稳定性及半衰期

如表2所示，各突变体的半衰期均有所提升，各单点突变体中S265H稳定性最好，其在最适温度55 ℃条件下的半衰期为90.39 min，是野生型的4 倍以上，在75 ℃条件下的半衰期比野生型提升了1.77 倍。复合突变体S265H/S267F的稳定性提升效果更为显著，在55 ℃条件下的半衰期为148.81 min，较野生型提升了6.35 倍，较S265H提升了64.63%；在75 ℃的条件下，复合突变体的半衰期较野生型提升了4.01 倍，较S265H提升了81.14%，可见其耐热性远优于野生型和其他突变体，具有更高的热稳定性，为其在各种高温环境下的开发应用奠定了基础。

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突变体酶分子结构的变化分析

为了进一步探究双突变体热稳定性提高的分子机制，本研究对S265H/S267F的表面静电势进行初步分析。如图8A所示，在野生型蛋白酶AprEbl中，氨基酸残基S265和S267均位于蛋白质表面上不带电荷的区域内。然而将Ser突变为His和Phe后，His和Phe的较大侧链增大了溶剂可及表面积，改变了静电势的分布，形成了双电层，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域。这一变化使该区域的电位正移，显著提升了突变体的整体稳定性。因此，由S265H/S267F突变诱导蛋白质表面上静电势的变化有利于维持高度稳定的构象，从而提高突变体的热稳定性。

Ser本身为亲水氨基酸，可能与周围水分子形成竞争性氢键，从而抑制内部氢键的形成，影响蛋白质的整体稳定性。突变为His和Phe后，侧链结构发生变化，可能增加蛋白质内部的疏水相互作用（图8B），从而有助于折叠并稳定结构，减少不稳定的无规卷曲结构。

如图8C所示，突变体的RMSF值整体显著低于野生型，特别在3 个柔性区域183NSIG186、265SGS267和318GTY320差异尤为明显，突变体降低了酶整体及局部区域的柔性，从而提升了酶的热稳定性。

结构分析进一步揭示了突变对蛋白质局部微观结构的影响，结果如图8D所示。将位于蛋白质表面且亲水的S265和S267突变为疏水氨基酸H265和F267后，H265的氨基（—NH2）与F267的羧基（—COOH）形成了新的氢键相互作用，此外，His的侧链含有一个能够形成氢键的咪唑环，在一定程度上能够增强该区域结构的稳定性。因此，突变后蛋白质局部相互作用增强以及新表面静电荷的形成，可能是复合突变体S265H/S267F相比野生型酶具有更好热稳定性的主要原因。

讨论与结论

碱性蛋白酶能够有效分解饲料中的蛋白质，显著提升氨基酸的利用率，从而提高饲料的消化率和营养吸收效率。在家禽和猪等动物的饲养中，添加碱性蛋白酶可有效促进其生长并提高饲料转化率。然而，饲料加工过程通常需要经历高温调质、膨化或制粒等工艺，温度往往超过80 ℃甚至更高，而目前市售的碱性蛋白酶大多耐热性不足，在高温条件下易失活，因此开发在高温条件下仍能够保持较高酶活性及稳定性的碱性蛋白酶变得尤为重要。而本研究所得复合突变体S265H/S267F在55 ℃条件下的半衰期为148.81 min，较野生型增长了6.35 倍，75 ℃的半衰期较野生型增长了4.01 倍，其热稳定性提高的同时能够与野生型的比活力保持一致，显示出相当大的工业应用潜力。

在本研究中，B-factor分析是设计蛋白酶AprEbl热稳定性优势变体的关键步骤，因为B-factor值反映了蛋白质波动和特定位置原子的刚性，更高水平的刚性可以改善蛋白质的热稳定性。相较于传统的方法，通过计算机模拟分析可以预测特定突变对酶活性、温度稳定性、pH值适应性和底物特异性等特性的影响，从而高效地筛选出潜在的正向突变，不仅能为突变提供理论支持，同时使设计更为精准，提高实验效率的同时也能够减少实验次数及资源消耗。

实际上，在酶的改造研究中酶活力与热稳定性间常存在权衡效应，提升热稳定性通常伴随着酶活力的降低。然而，本研究中的复合突变体S265H/S267F却表现出独特优势。与目前市售的碱性蛋白酶相比，S265H/S267F热稳定性显著提升。同时，该突变体的比活力并未出现明显下降。而另一突变体N183W/G186I活性出现大幅下降，推测是由于改造直接对关键活性位点附近的结构产生影响，降低了该区域的柔性，进而对酶活力造成不利影响。而265和267位点的突变可能维持了活性中心附近的微环境，保障了酶与底物或辅助因子之间的结合，保留其活性，从而赋予了S265H/S267F较高的商业价值，使其在工业应用等领域极具潜力。

综上，本研究有望拓宽高温环境下碱性蛋白酶的应用范围，碱性蛋白酶具有更好的热稳定性能够为开发新的生产工艺提供可能，对于其工业化生产也具有积极意义，提高产品质量的同时能够推动产业转化升级，促进其可持续发展。此外，本研究的设计改造思路可以为改造碱性蛋白酶的杆菌蛋白酶E提供指导，为饲料、食品等工业领域提供更高效、稳定的酶制剂。

作者简介

通信作者：

刘艳，安徽工程大学生物与食品工程学院教授、博士生导师、安徽省领军人才特聘教授，安徽工程大学合成生物学与微生物制造团队带头人。中科院合肥物质科学院生物物理学博士，美国弗吉尼亚联邦大学访问学者，安徽省生物工程学会常务理事。先后主持国家自然科学基金（面上、青年）3 项，安徽省自然科学基金、省高校杰出青年基金等省部级项目10余项。发表高水平SCI论文30余篇，授权国家发明专利十余件（其中国际专利2 件）。主要从事发酵过程中群体微生物结构与功能、微生物及其代谢机理、微生物新酶及其分子改造等研究工作，从基因组学、蛋白组学和代谢组学的水平上，解析微生物发酵机制、探索微生物酶蛋白的结构与催化功能的相互关系，提升和改造传统发酵工艺，采用合成生物学技术发掘和延展新的生物制造过程，满足工业生物制造的需求。

本文《基于理性设计的碱性蛋白酶AprEbl热稳定性改造及其潜在机制分析》来源于《食品科学》2025年46卷第12期109-117页，作者：罗雅妮，胡刘秀，刘志钰，高旭丽，陈 宇，吴传超，刘艳。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241129-208。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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