悉尼大学开发哺乳动物细胞定向进化新平台，加速生物分子功能改造

定向进化如同在分子世界中进行一场精准的“人工育种”，通过持续引入突变并筛选出更优的变体，成为改造酶、抗体和基因开关等生物分子的核心手段。然而，这项技术长期以来主要依赖于细菌或酵母等系统，其生物环境的简化使其难以复制哺乳动物细胞内复杂的翻译后修饰、蛋白互作网络以及信号通路等生态背景。在哺乳动物细胞中直接进行定向进化，不仅更贴近人体环境，而且可望获得更加适配的生物分子，但这一目标长期受限于系统稳定性、进化效率、安全性以及宿主背景干扰等多重挑战。

悉尼大学 Gregory Neely 团队近日在 Nature Communications 上报告了一项突破性成果，题为“A chimeric viral platform for directed evolution in mammalian cells”，开发出一个名为 PROTEUS 的定向进化平台。这一平台的核心在于构建了一种嵌合病毒样囊泡系统，首次实现在哺乳动物细胞中稳定运行超过 30 轮的定向进化过程，解决了长期困扰该领域的系统崩溃与作弊颗粒问题，为构建可在人体内高效运行的分子工具开辟了新路径。

PROTEUS 平台的设计灵感来自对传统病毒系统缺陷的深入剖析。研究团队摒弃了原始病毒的致病性结构组件，保留 Semliki Forest 病毒的非结构蛋白复制子，用水疱性口炎病毒（VSV）的 G 蛋白（包膜糖蛋白）取代 SFV 自身的包膜结构，实现膜融合与细胞侵染。更关键的是，平台将目标蛋白功能与 VSV-G 蛋白的表达紧密耦合，确保只有在目标蛋白具备预期功能时，细胞才能生产可包装 RNA 的囊泡。这一策略一方面避免了结构蛋白与基因组重组形成作弊颗粒的可能，另一方面也将分子功能与适应性选择紧密绑定，实现了进化系统的正向驱动。

这一循环包括目标基因进入复制子、在细胞中易错复制产生多样性、功能性变体驱动 VSVG 表达、VSVG 包装带有新突变的基因组 RNA 形成 VLVs，VLVs 释放后感染新一轮细胞，继续迭代。如此往复，形成一个自主闭环的进化系统。进化实验显示，目标基因保有率>96%；平台整体支持超过 30 轮的稳定迭代，表明其在细胞内具备出色的稳定性。此外，得益于 RNA 复制酶的天然高错误率，该平台初始突变率可达每 10 万细胞 2.6 个突变，为定向进化提供了充足的序列多样性基础。

为了验证 PROTEUS 的实战能力，研究人员展示了三个典型的成功案例。其一是tTA 蛋白的进化实验，该蛋白通常在存在四环素类抗生素时被抑制活性。研究团队将其与 VSVG 表达系统绑定，经过多轮筛选，获得了包含两个关键突变的 tTA 变体，表现出强烈的抗药性。这一组合此前仅在细菌中历经长周期进化方可获得，PROTEUS 则在哺乳动物系统中迅速实现，充分显示了其高效性。

第二个案例针对已高度优化的 rtTA-3G 基因开关系统，研究目标是进一步提升其对诱导剂的敏感性。通过设置逐步降低选择压力的进化路径，平台在第 30 轮筛选出拥有两个关键突变的变体，其半数激活浓度从原型的 39 ng/mL 降至 7 ng/mL，灵敏度提高约五倍。在类胚体模型中测试后，这一变体展现出远超原型的诱导性能。进一步分析表明，这一优化效应仅在哺乳动物细胞中出现，表明 PROTEUS 能够捕捉到原核系统中不具优势的适应性突变。

第三个案例聚焦于细胞内纳米抗体的性能改造。研究团队选取了靶向 p53 的 Nb139 纳米抗体作为模型，其原始版本在应对 DNA 损伤信号时反应迟缓，缺乏有效核定位。通过构建基于 p53 结合依赖性的 VSVG 表达回路，系统在 35 轮迭代中筛选出具有核内斑点形成能力的突变体，尤其是携带 S26P 突变的版本在顺铂处理后表现最为显著。该突变位于框架区，未直接影响抗原结合，提示其可能提升了抗体的稳定性、折叠效率或亚细胞运输能力。

为进一步拓展系统的应用潜力，研究团队探索了提高突变率和改变突变偏好的手段。他们发现平台中的突变谱受到 ADAR 酶介导的 A>G 偏好影响，而敲除 ADAR 虽可改变突变方向，但会显著降低整体突变率。为此，他们引入了病毒诱变剂 Molnupiravir，这一化合物在低毒性条件下能使突变率提升 8 倍，并拓展突变类型。这意味着，研究者可根据实验目标灵活调控进化压力，精细导航探索路径。

ROTEUS 平台的核心优势在于其哺乳动物细胞特异性环境，可进化出适配复杂翻译后修饰与信号网络的分子；系统稳定性成功规避了作弊颗粒导致的崩溃风险；高效筛选多位点协同突变的能力，加速了复杂功能演化；广泛兼容性已应用于转录因子、抗体等蛋白，并能联用诱变剂（如 Molnupiravir）提升突变率。当前局限在于主要依赖 BHK-21 细胞（弱干扰素特性提供宽容环境），向人源细胞拓展需克服先天免疫屏障；复杂靶点与回路的调控平衡仍需优化。

该平台将开源供学术研究使用，同时核心专利已布局，为合成生物学、基因治疗及药物研发提供了变革性工具，推动哺乳动物分子工程进入“精准快速驯化”时代。

1.Cole, A.J., Denes, C.E., Moreno, C.L. et al. A chimeric viral platform for directed evolution in mammalian cells. Nat Commun 16, 4250 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-59438-2

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