中科院1区-广西医大一附院：基于代谢组与转录组学分析揭示山药多糖对顺铂诱导的肾间质纤维化的保护作用

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导读

据报道山药多糖（SYDT）可保护糖尿病肾病小鼠的肾功能并减轻其肾脏纤维化。本研究的目的是基于多组学分析，利用体内模型确定SYDT对顺铂(CDDP)诱导的慢性肾间质纤维化(RIF)的影响及其潜在的分子机制。

给大鼠腹腔注射单剂量CDDP，然后用SYDT或氨磷汀（AMF）治疗。检测尿液中N-acetyl-β-d-glucosaminidase (NAG)、血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)的水平，以评估肾功能。分别使用苏木精和伊红（H&E）以及Masson三色染色法评估肾组织损伤和纤维化。此外本研究还应用转录组学和代谢组学预测了SYDT的可能作用机制，并通过多项相关检查进行了验证。

SYDT可显著改善CDDP大鼠的肾功能，减轻肾组织损伤和纤维化，降低vimentin、α-SMA和CTGF的蛋白水平，而SYDT能明显提高CDDP大鼠肾组织中MMP-1的蛋白水平。通过转录组分析，CDDP模型组和SYDT-M组之间有1130个不同表达基因（DEGs），这表明代谢通路可能是主要的相关靶点。与转录组分析一致，代谢组分析在SYDT-M组和CDDP模型组之间发现了276种差异表达代谢物（DEMs），主要集中在甘油磷脂代谢中。转录组和代谢组的综合分析表明，SYDT通过调节靶基因Gpd2、Gpam、Agpat3、Lcat和Pla2g4b，抑制了甘油磷脂代谢途径。分析表明，PLD信号通路可能是最相关的靶点。此外相关的信号通路分析证实，SYDT通过下调PLD通路抑制了CDDP诱导的大鼠RIF。

研究表明SYDT可以通过抑制甘油磷脂代谢和PLD信号通路来缓解CDDP

诱导的体 内 RIF 。

论文ID

原名：Multi-omics analysis reveals the protective effects of

Chinese yam

译名：多组学分析揭示山药多糖对顺铂诱导的肾间质纤维化的保护作用

期刊：Phytomedicine

IF：8.3

发表时间：2024.11

通讯作者：杨玉芳

通讯作者单位：广西医科大学第一附属医院

实验设计

实验结果

1.SYDT可减轻CDDP诱导的RIF大鼠的肾功能、肾损伤和肾纤维化

实验设计和药物处理如表1所示。与正常组相比，CDDP模型组的BUN、Scr和尿液NAG水平显著升高。与CDDP模型组相比，SYDT治疗组和AMF组的BUN、Scr和尿液NAG水平显著下降，此外SYDT-M组的BUN和Scr水平显著低于SYDT-L组，SYDT-H组的尿NAG水平显著低于SYDT-M组（图1A-C）。

H&E染色结果显示正常组的肾组织无组织病理学损伤。与正常组相比，CDDP模型组肾小管萎缩（黑色箭头），部分肾小管上皮细胞变性、水肿或坏死（空心箭头），肾间质内有大量炎性细胞浸润（黑色三角形）（图1D）。此外CDDP模型组的肾小管损伤评分显著高于正常组，而SYDT处理组和AMF组的肾小管损伤评分则显著低于CDDP模型组（图1E）。此外SYDT-H组的肾小管损伤评分显著低于SYDT-M组（图1E）。

Masson三色染色分析表明，正常组肾脏组织中没有纤维化，而CDDP治疗导致了明显的RIF（图1F）。与正常组相比，CDDP模型组的RIF相对面积显著增加。相反与CDDP模型组相比，SYDT处理组和AMF组的RIF相对面积显著缩小。值得注意的是，随着SYDT剂量的增加，RIF的相对面积显著缩小（图1G）。

图1 SYDT对CDDP诱导的RIF大鼠肾功能、病理性肾损伤和肾纤维化的影响。（A-C）大鼠BUN、Scr和尿NAG水平。（D）H&E染色肾组织样本的代表性图像，放大倍率× 400（黑色箭头：肾小管扩张和萎缩。空心箭头：肾小管上皮细胞水肿、变性或坏死。黑色三角形：炎性细胞浸润）。（E）各组大鼠肾组织的肾小管间质损伤评分。（F）Masson三色染色肾组织样本的代表性图像。放大倍率×400。（G）各组大鼠肾组织纤维化的相对面积（%）。与正常组相比，*P<0.05；与CDDP模型组相比，#P<0.05；与SYDT-M组相比，&P<0.05（n=8-10）。

表1 实验设计和药物处理

2. SYDT对CDDP诱导的RIF大鼠肾脏组织中波形蛋白（vimentin）、α-SMA、CTGF和MMP-1水平的影响

WB分析表明，与正常组相比，CDDP模型组的波形蛋白、α-SMA和CTGF水平显著升高，而MMP-1水平则显著下降。相比之下，SYDT治疗组和AMF组的波形蛋白、α-SMA和CTGF蛋白水平相对于正常组显著下降，而MMP-1的表达则有所增加（图2）。此外与SYDT-L组相比，SYDT-M组的波形蛋白、α-SMA和CTGF蛋白水平显著下降（图2B-D）。与SYDT-M组相比，SYDT-H组的波形蛋白和CTGF蛋白水平显著下降（图2C-D）。

图2 SYDT对大鼠肾组织中α-SMA、波形蛋白、CTGF和MMP-1蛋白表达水平的影响。(A）大鼠肾组织中α-SMA、波形蛋白、CTGF和MMP-1表达的WB分析。(B-E)肾组织中α-SMA、波形蛋白、CTGF和 MMP-1蛋白水平的定量分析。与正常组相比，*P<0.05；与CDDP模型组相比，#P<0.05；与SYDT-M组相比，&P<0.05（n=3-4）。

3. SYDT对CDDP诱导的RIF大鼠肾组织转录组的影响

主成分分析（PCA）显示，正常组、CDDP模型组和SYDT-M组的基因表达存在显著差异（图3A）。热图显示，CDDP模型组的趋势与正常组相反。然而SYDT治疗逆转了这一异常趋势，表明SYDT恢复了CDDP诱导的异常转录组图谱（图3B）。火山图显示，CDDP模型组和SYDT-M组之间存在1130个DEGs，其中558个基因下调，572个基因上调（图3C）。这些DEGs可能涉及分子功能（MF）、细胞成分（CC）和生物过程（BP）（图3D）。此外KEGG通路分析显示了40多个信号通路，表明这些DEGs主要富集在代谢通路中（图3E）。

图3 转录组学分析预测了SYDT的潜在靶标。(A)正常组、CDDP组和SYDT组的PCA评分图。(B) 正常组、CDDP和SYDT的热图。(C) CDDP与SYDT的基因火山图。(D) 基因本体（GO）富集分析。(E) CDDP组 vs SYDT-M组的KEGG通路分析。(Nomal：正常组；CDDP：CDDP模型组；SYDT：SYDT-M组)。

4. SYDT对CDDP诱导的RIF大鼠肾组织代谢的影响

转录组数据分析预测，SYDT抗肾脏纤维化的潜在机制可能涉及代谢途径。因此采用非靶向代谢组学方法评估了SYDT对代谢组的影响。PCA图显示，质量控制（QC）样本之间存在一定程度的分散，但R2X=0.486>0.4表明主成分差异不大（图4A）。此外从基峰强度（BPI）色谱图来看，峰形差别不大，表明质控样品的代谢轮廓基本相同（图4B）。这些数据表明，超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）的重复性和稳定性较高，可用于后续检测。

如图4C所示，与正常组相比，服用CDDP后会导致BPI色谱异常改变，尤其是在4-5分钟、5-6分钟和10-11分钟范围内。然而SYDT治疗逆转了这些异常改变，表明SYDT能够在一定程度上改善CDDP诱导的异常代谢组谱。

正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）显示CDDP模型组和SYDT-M组之间存在显著差异（图4D），OPLS-DA循环检验也证实了这一点（图4E）。进一步分析发现CDDP模型组和SYDT-M组之间有276种DEMs（图4F）。值得注意的是，CDDP模型组与SYDT-M组之间的DEMs主要富集于甘油磷脂代谢和叶酸的一个碳池（P<0.05，impact> 0.1）（图4G）。在这些途径中，甘油磷脂代谢途径的相关性最高（图4G）。

图4 SYDT能调节CDDP引起的代谢紊乱。(A）质控样本的PCA评分图；（B）质控样本的BPI图；（C）BPI色谱图；（D）CDDP vs SYDT的OPLS-DA图；（E）CDDP vs SYDT的OPLS-DA检验图；（F）CDDP vs SYDT的代谢物火山图；（G）富集的代谢通路。(Nomal：正常组。CDDP：CDDP 模型组。SYDT：SYDT-M 组）。

5.代谢途径分析的结果

代谢途径分析表明，CDDP模型和SYDT-M组之间的DEMs（代谢物）主要参与甘油磷脂代谢（表2）。

表2 代谢途径分析的结果

6.转录组和代谢组的综合分析

为了深入研究转录组和代谢组之间的相关性，我们使用R软件包和Spearman方法计算了相关系数。相关系数数据（|r|>0.80）被分成1-9个象限：第1和第9象限表明基因与代谢物负相关；第3和第7象限显示正相关，第5象限表示不显著，其余象限为部分相关。九象限图显示多个基因与代谢物之间存在负相关或正相关，表明代谢可能受到转录组的影响（图5A-B）。

代谢组学分析表明，SYDT会影响甘油磷脂代谢途径。为了阐明SYDT如何调节这一途径，研究人员对转录组学和代谢组学进行了整合分析。综合分析预测，SYDT可调控靶基因Gpd2、Gpam、Agpat3、Lcat 和 Pla2g4b的表达，从而影响磷脂酰乙醇胺（C00350: PE (22:5/22:6)）的合成，最终调控甘油磷脂代谢途径（图5C）。此外定量分析表明，SYDT在一定程度上显著提高了Gpd2、Gpam和Agpat3的水平，降低了Lcat和Pla2g4b的水平。SYDT能显著降低PE（22:5/22:6）的含量（图5D-I），这些数据进一步证实了上述预测。

图5 转录组和代谢组的综合分析。(A-B)九象限图显示了基因和代谢物的相关性。x轴和y轴代表基因和代谢物的log2比值。黑点线代表不同的阈值。(C）甘油磷脂代谢途径。(D-I）Gpd2、Gpam、Agpat3、Pla2g4b、Lcat的表达水平和PE（22:5/22:6）的含量。与正常组相比，*P<0.05；与CDDP相比，#P<0.05。(Normal：正常组；CDDP：CDDP模型组；SYDT：SYDT-M组）。

7. SYDT可抑制磷脂酶D(PLD)信号通路

转录组和代谢组的综合分析表明，SYDT显著改变了靶基因Agpat3和Pla2g4b的表达。有趣的是，Agpat3和Pla2g4b共同富集于PLD信号通路。因此验证了抑制PLD信号通路是否是SYDT缓解RIF的关键。WB分析显示相对于正常组，CDDP模型组的PKCβ、PLD2和PLD4蛋白水平显著升高。相比之下，与CDDP模型组相比，SYDT处理组和AMF组的PKCβ、PLD2 和 PLD4水平显著降低（图6A-D）。此外与SYDT-L组相比，SYDT-M组的PKCβ蛋白水平显著降低，此外与SYDT-M组相比，SYDT-H组的PKCβ和PLD4水平显著降低（图6B-D）。

ELISA显示，CDDP模型组的PA含量明显高于正常组。相反与CDDP模型组相比，SYDT处理组和AMF组的PA含量显著降低，此外与SYDT-M组相比，SYDT-H组PA含量显著降低（图6E）。

图6 SYDT抑制了PLD信号通路。（A）大鼠肾组织中PKCβ、PLD2和PLD4表达的WB分析。（B-D）肾组织中PKCβ、PLD2和PLD4蛋白水平的定量分析。（E）用酶联免疫吸附法检测大鼠肾组织中的PA水平。与正常组相比，*P<0.05；与CDDP相比，#P<0.05；与SYDT-M组相比，&P<0.05。

CDDP是临床常用的化疗药物，但常用剂量的CDDP很容易导致AKI。如果不及时治疗，AKI可能会发展成RIF。在本研究中，大鼠暴露于CDDP后，尿NAG、Scr、BUN水平以及RIF、肾小管损伤评分、肾组织中的波形蛋白、α-SMA和 CTGF蛋白水平均显著升高，而MMP-1蛋白水平则显著降低（P<0.05）（图1-2）。这些结果表明单剂量CDDP可诱导大鼠RIF。然而CDDP诱导RIF的机制尚不清楚，也缺乏有效的治疗措施。

一些研究表明，部分中药可以减少RIF的发生。山药是中国丰富的资源，而SYDT是山药中最重要的生物活性成分。由于其成分和结构复杂，SYDT具有多种功能，包括免疫调节、抗炎、抗氧化、抗肿瘤。最近的一项研究报告称，SYDT能保护糖尿病肾病小鼠的肾功能并减少肾纤维化，但具体机制尚未研究清楚。在我们的研究中，SYDT治疗显著降低了CDDP 诱导的大鼠尿NAG、Scr和BUN水平的升高（P<0.05）（图1A-C）。SYDT还能显著降低CDDP诱导的大鼠肾组织的RIF程度以及高水平的波形蛋白、α-SMA和CTGF，而MMP-1水平则显著升高（P<0.05）（图1-2）。这些结果表明SYDT可保护大鼠的肾功能并改善CDDP诱导的RIF。

随后，我们利用转录组分析详细研究了SYDT抵抗RIF的潜在机制。在这项研究中，RNA-seq发现CDDP模型组和SYDT-M组之间存在1130个DEGs，这些DEGs在多个通路中富集（图3）。KEGG通路分析表明代谢通路是最相关的靶点（图3）。

因此我们研究了SYDT对肾损伤和肾纤维化的保护作用是否与转录组分析显示的代谢有关。在SYDT-M和CDDP模型组之间发现了276个DEMs，这些 DEMs主要富集在甘油磷脂代谢途径中（图4）。

甘油磷脂被认为是生理活性化合物的来源，也是细胞膜的重要组成部分。它们不仅是信号分子，还是细胞膜内蛋白质的锚定物。甘油磷脂代谢紊乱会破坏细胞膜的生理结构，导致细胞物质交换和信号转导功能受损。当细胞中甘油磷脂过多时，可能会引起脂质中毒，最终破坏肾脏细胞。

在本研究中，转录组和代谢组的综合分析表明，SYDT可调控靶基因（Gpd2、Gpam、Agpat3、Lcat和Pla2g4b）的表达，从而减少靶代谢产物（磷脂酰乙醇胺）的合成，抑制甘油磷脂途径（图5）。这些数据表明SYDT可恢复甘油磷脂代谢，有助于减轻肾细胞损伤和肾纤维化。

值得注意的是Agpat3和Pla2g4b（DEG之一）共同富集于PLD信号通路。因此PLD信号通路可能参与了SYDT对纤维形成的调控。PKCβ是一种经典的蛋白激酶C，UUO小鼠的肾纤维化与PKCβ 的激活有关。当受到刺激时PKCβ被激活并转运到膜上，在膜上通过非磷酸化的蛋白-蛋白相互作用激活PLD，从而参与细胞信号传导。PLD2和 PLD4属于 PLD 家族，该家族由PLD1-PLD6六个成员组成。根据之前的报道，PLD2参与了小鼠肺纤维化的进展，PLD2在CKD大鼠模型中表达增加。在两种不同的肾脏纤维化模型中，PLD2和PLD4 的mRNA水平显著增加，PLD4基因敲除导致抗纤维化细胞因子增加。PLD可催化底物磷脂酰胆碱（PC）产生PA。作为脂质的次级信使，PA可调节多种信号通路和细胞功能。PA是一种没有头部基团的极性脂质，其独特的化学结构可影响细胞膜的特性。PA的积累会破坏细胞膜的完整性，并最终损害肾细胞。这些报告表明，PKCβ、PLD2、PLD4和PA与RIF有关。

SYDT治疗显著降低了这些蛋白的表达（P<0.05）（图6）。这些结果表明SYDT通过下调PLD通路抑制了CDDP诱导的大鼠RIF，而PLD通路对于减少细胞外基质的积累和纤维化的发展至关重要。

由于CDDP在肾小管中蓄积，并通过主动或被动转运进入肾小管上皮细胞，因此 CDDP诱导的肾损伤以肾小管上皮细胞损伤为主。在本研究中，CDDP暴露明显激活了大鼠肾组织中的PLD通路，导致PKCβ、PLD2和PLD4水平升高，造成PA蓄积和肾小管上皮细胞损伤，导致肾小管间质炎症损伤和纤维化，大鼠肾功能持续下降。此外SYDT治疗可抑制PLD通路，上述表现得到改善。因此SYDT可能是一种通过抑制PLD通路治疗CDDP诱导的RIF的潜在药物。

本研究对未来的临床实践有几方面的意义。本研究通过转录组学和代谢组学分析获得的PLD通路的相关分子可能是药物干预的潜在靶点，未来有可能针对这些靶点进行药物开发。此外本研究的结果还为SYDT的实际应用提供了理论依据，表明SYDT可能是一种针对CDDP诱导的RIF的潜在药物。这意味着SYDT未来可作为一种辅助治疗药物，有望缓解CDDP化疗患者的RIF，提高患者的生存质量。

总之本研究首次报道了SYDT可通过调节PLD信号通路来改善CDDP诱导的大鼠RIF。这些发现可能为缓解CDDP诱导的RIF提供了一种策略。

本文提出了创新之处：首先，这是第一项综合使用转录组学和代谢组学方法揭示SYDT对CDDP诱导的RIF的保护机制的研究。其次SYDT通过下调PLD信号通路有效改善了CDDP诱导的RIF。

图7 SYDT抗CDDP诱导的RIF的机制。SYDT通过抑制PLD信号通路和甘油磷脂代谢通路缓解肾细胞和肾纤维化。

此外本研究有一定的局限性。首先它只是基于体内研究。要全面阐明SYDT抗CDDP引起的RIF的潜在机制，还需要进一步的体外实验。其次，由于客观条件的限制，本研究无法确定SDTY对CDDP引起的肾损伤患者的影响。

结论

本研究首次表明，SYDT能有效保护CDDP诱导的RIF大鼠的肾功能，减轻肾组织损伤和纤维化。还利用转录组学和代谢组学技术，首次报道了CDDP通过抑制甘油磷脂代谢途径诱导体内RIF。SYDT对PLD信号通路的调控也是一种新的可能机制（图7）。这些策略可能会改善CDDP诱导的RIF，并有助于SYDT在RIF中的应用。

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0944711324008572?via%3Dihub

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