表面等离子体共振技术测定肠道病毒71型灭活疫苗抗原含量方法的建立和验证

中文摘要

目的应用表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）技术快速检测肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）灭活疫苗抗原含量，并对该方法进行验证。

方法将兔抗EV71抗体偶联到SPR芯片表面，监测EV71抗原与抗体结合后SPR 芯片表面信号的变化。使用EV71国家抗原标准品建立SPR检测EV71抗原的新方法，验证该方法的线性、专属性、精密度和准确度。取6批次疫苗原液进行抗原检测，比较SPR与ELISA 2种检测方法的差异。

结果兔抗EV71抗体对EV71具有良好的亲和能力，偶联水平为8 037响应单位。EV71国家抗原标准品的抗原含量在12.5～200.0 U/mL时，与SPR仪响应值的变化量呈良好的线性关系，决定系数≥0.990 0。芯片与Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗、PBS均无交叉反应。重复性和中间精密度的相对标准偏差分别为1.52%和1.54%。准确度的回收率在91.70%～103.85%。SPR技术和ELISA检测不同批次疫苗原液抗原含量，虽差异有统计学意义（Z=-2.201，P=0.028），但2种方法检测的相对标准偏差＜15%，且结果趋势一致。

结论建立并验证了应用SPR技术检测EV71抗原含量的新方法，该法线性、专属性、精密度、准确度良好，可用于EV71灭活疫苗抗原含量的快速检测。

正文

肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是引起儿童手足口病的主要病原体，其神经嗜性可引起神经系统并发症，少数患者并发无菌性脑膜炎、急性松弛性瘫痪和脑干脑炎等重症。目前我国已有多家企业的EV71灭活疫苗获批上市，疫苗的广泛应用有效控制了手足口病的发生和流行。

EV71疫苗的抗原含量是评价该疫苗有效活性成分的关键指标，也是该疫苗多个生产阶段的关键质量控制参数。ELISA是检测EV71疫苗抗原含量的常用方法，具有特异性强、敏感度高等优点，国内多家疫苗生产企业及实验室均建立了该方法。然而，ELISA易受温度、反应时间以及人员操作等因素影响，导致不同实验室间检测结果可比性较差。采用其他技术，如表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）技术进行抗原含量检测，有利于提高企业的质量控制水平与生产效率。SPR技术是近年来发展的生物分子检测技术，该技术可以在蛋白无标记的情况下，实时、高灵敏度地检测蛋白间的相互作用。SPR 技术作为非标记免疫化学方法收录于中国药典2020年版三部。

本研究拟建立SPR技术快速检测EV71抗原含量的新方法，并与ELISA的检测结果进行比较，以期为疫苗生产工艺开发及品质控制提供技术支持。

1

材料与方法

1.1

材料

EV71国家抗原标准品（批号：300016-202002）购自中国食品药品检定研究院；6批EV71灭活疫苗原液由中国医学科学院医学生物学研究所提供。

1.2

主要试剂及仪器

兔抗EV71抗体、0.01 mol/L PBS、EV71抗原检测ELISA板由中国医学科学院医学生物学研究所提供；Spectra M5酶标仪购自美国Molecular Devices公司；0.01 mol/L醋酸钠、0.01 mol/L甘氨酸盐酸溶液、氨基偶联试剂盒、系统缓冲液HBS-EP buffer、CM5芯片以及Biacore T200生物分子相互作用系统均购自美国Cytiva公司。

1.3

检测方法建立

将兔抗EV71抗体用pH5.0的0.01 mol/L醋酸钠稀释至约50 μg/mL，利用氨基偶联法将抗体偶联于CM5芯片抗体通道。偶联结束后将EV71国家抗原标准品溶液上机检测，样品流过SPR芯片表面时与偶联的抗体结合，10 μL/min，反应5 min，监测SPR仪响应值变化。

1.4

抗体对EV71抗原亲和能力测定

将EV71灭活疫苗原液2倍梯度稀释至9.50、4.75、2.38、1.19、0.59、0.30 μg/mL，上机检测，流过SPR芯片表面时与标记的抗体结合，30 μL/min，反应5 min，监测SPR仪响应值，采用Biacore T200 Evaluation 3.2.1软件拟合异质配体模型。本实验使用的兔抗EV71抗体为多克隆抗体，使用异质配体模型拟合获得数据，计算结合速率常数（association rate constant，ka）、解离速率常数（dissociation rate constant，kd） 、解离平衡常数（ dissociation constant，KD）。计算公式：KD= kd /ka。

1.5

方法学验证

1.5.1　线性将EV71国家抗原标准品系列稀释至12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 U/mL，用建立的SPR技术检测EV71抗原含量，以抗原含量为x轴，相对响应值为y轴，进行线性回归，建立回归方程，计算回归曲线的决定系数（R2）。可接受标准：R2≥0.990 0。

1.5.2　专属性以EV71灭活疫苗原液40倍稀释液作为阳性对照，系统缓冲液作为阴性对照，应用建立的SPR技术检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗原液、0.01 mol/L PBS的响应值。以阴性对照x̅+3s为临界值，可接受标准：EV71灭活疫苗原液40倍稀释液检测结果为阳性，Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗原液、0.01 mol/L PBS的检测结果为阴性。

1.5.3　精密度

1.5.3.1　重复性取EV71灭活疫苗原液，应用SPR技术检测抗原含量，重复测定6次，计算抗原含量的均值及相对标准偏差（relative standard deviation， RSD）。可接受标准：RSD<2%。

1.5.3.2　中间精密度取EV71灭活疫苗原液，同一检测人员在不同日期各检测6次抗原含量，计算RSD。可接受标准：RSD<2%。

1.5.4　准确度取EV71国家抗原标准品，稀释至122.0、61.0、30.5 U/mL，采用SPR技术检测EV71抗原含量，每个浓度重复检测3次，计算回收率及RSD。可接受标准：回收率为90%～110%，RSD <5%。

1.5.5　SPR与ELISA测定结果对比取6批EV71灭活疫苗原液，分别用ELISA和SPR技术检测抗原含量，比较2种检测方法的差异。

1.6

统计学分析

应用SPSS 27.0 软件进行统计学分析，采用非参数两相关样本的Wilcoxon符号秩检验统计分析实验数据，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2

结果

2.1

抗体的偶联水平

兔抗EV71抗体的偶联水平（固定化响应值－基线响应值）为8 037响应单位（response unit，RU），表明抗体的偶联水平较高，结果见图1。

2.2

抗体对EV71抗原的亲和能力

2倍梯度稀释EV71疫苗原液后，不同浓度EV71抗原的吸附平衡曲线见图2。ka为1.00×106和1.08×107 （mol/L）-1·s-1，kd为3.55×10-8和1.01×10-8 s-1，KD为3.55×10-14和9.35×10-16 mol/L，表明SPR芯片上标记的兔抗EV71抗体对EV71抗原具有良好的亲和能力。

2.3

线性

根据3次实验结果分别绘制标准曲线，EV71抗原含量在12.5～200.0 U/mL的3次实验R2分别为0.995 4、0.994 9、0.998 5，符合R2≥0.990 0的标准，表明该范围内EV71抗原含量与响应值线性良好，见图3。

2.4

专属性

EV71灭活疫苗原液、Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗原液、0.1 mol/L PBS、系统缓冲液的响应值均值分别为27.95、-2.75、-0.75、4.93 RU，以阴性对照系统缓冲液计算的临界值为5.28 RU。结果显示，EV71灭活疫苗原液检测结果为阳性，Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗原液、0.1 mol/L PBS检测结果为阴性，符合检测标准，表明该检测方法的专属性良好。结果见表1。

2.5

精密度

2.5.1　重复性EV71抗原含量的6次检测结果的RSD为1.52%，符合RSD<2%的检测标准，表明该方法重复性良好，结果见表2。

2.5.2　中间精密度同一实验人员在不同日期各检测6次EV71抗原含量的RSD为1.54%，符合RSD<2%的检测标准，表明该方法的中间精密度良好，结果见表3。

2.6

准确度

如表4所示，3批不同浓度样品的平均回收率分别为96.15%、102.66%、96.59%，9组样品的回收率在91.70%～103.85%，总平均回收率为98.47%，RSD在0.38%～4.39%，均<5%，满足检测标准，表明基于SPR技术检测EV71抗原含量方法的准确度良好。

2.7

SPR技术与ELISA测定结果比较

对SPR技术与ELISA测定结果进行统计学分析，差异有统计学意义（Z=-2.201， P=0.028），SPR技术检测的EV71抗原含量略低于ELISA，见表5。根据FDA指南，精密度检测的可接受标准为RSD≤25%。SPR与ELISA 2种检测方法的RSD＜15%，且2种方法检测结果的趋势一致，表明SPR的检测方法适用于EV71抗原含量检测，可作为使用ELISA检测EV71抗原含量的替代或补充方法。

3

目前，生物制品抗原含量的检测主要采用ELISA，该法耗时较长、操作步骤多、通量较小，检测效率有待提高。与ELISA相比， SPR具有自动化程度高、通量高、可实时监测、无需蛋白标记、样品用量少等优势，已被应用于脊髓灰质炎灭活疫苗、COVID-19疫苗、流感疫苗等多种疫苗检测中。

本研究将抗EV71抗体偶联至SPR芯片表面，该抗体特异性结合EV71抗原后，芯片表面的折光率变化使仪器产生响应值，响应值的变化水平与所结合的EV71抗原的含量相关。可通过监测仪器响应值，实时动态监测芯片表面偶联的抗体与EV71抗原之间的相互作用过程。已有关于ELISA检测EV71抗原方法的研究中，方法的准确度回收率在80%～120%，重复性和中间精密度的RSD在3.4%～15.0%，R2在0.98～0.994。本研究建立的SPR法准确度回收率在91.70%～103.85%、重复性和中间精密度的RSD分别为1.52%和1.54%、R2均在0.994 0以上，准确度、重复性和中间精密度、线性较好。比较SPR与ELISA测定6批次EV71灭活疫苗抗原含量发现，尽管2种方法检测结果的差异有统计学意义，但结果的RSD＜15%，该差异对EV71抗原含量的检测是可接受的。2种方法检测结果的差异可能由多种因素引起：ELISA操作相对复杂，人工操作多，易引入误差；多克隆抗体可能同时结合同一抗原不同结合位点，SPR偶联的抗EV71抗体与ELISA板偶联的抗体识别的抗原位点构象可能存在差异；SPR技术使用氨基偶联抗体至芯片表面时，部分抗体的抗原结合表位可能受到影响。2种方法中抗体与抗原结合能力的影响有待进一步考察。后续将尝试使用多种芯片探索研究，如Protein A芯片和链霉亲和素芯片分别通过结合抗体的Fc端、生物素亲和素的高亲和力结合来偶联检测抗体。本研究检测的EV71灭活疫苗原液批次相对较少，尚需进行多批次研究以对2种检测方法进行充分判断。

本研究建立的SPR技术检测EV71抗原含量方法精密度高，RSD＜2%，同时具有良好的准确度、专属性和重复性，可准确检测样品中EV71的抗原含量。该方法在检测抗原含量方面具有较广的应用前景，同时也可为疫苗生产全流程监测和质量检测提供更多可行方案。

作者

王永蓉 程晨 吴凡 刘勤 苏雯 方帷 杨雁霞 王玮

云南省食品药品监督检验研究院，工业和信息化部产业技术基础公共服务平台， 昆明 650106

通信作者：王玮，

Email：1014932221@qq.com

引用本文：王永蓉, 程晨, 吴凡, 等.表面等离子体共振技术测定肠道病毒71型灭活疫苗抗原含量方法的建立和验证[J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(3): 175-179.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241225-00095

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