动物行为与光电专题（58）丨化学遗传学调控小鼠疼痛和焦虑样行为

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第1部分：采用24只小鼠，模型组（SNI）16只、假手术组（sham）8只。其中SNI组建立右侧SNI模型，sham组则进行伤口对照，不损伤神经。造模后1d、7d、14d检测两组小鼠的右侧机械缩足反射阈值（PWT）；造模后14d进行高架十字迷宫实验；

第2部分：选取12只小鼠随机分为两组，即红藻氨酸组和对照组，每组6只。红藻氨酸组向左侧vmPFC注射红藻氨酸，而对照组向左侧vmPFC注射生理盐水。恢复7d后，对两组小鼠建立SNI模型。造模后14d，检测两组小鼠的右侧PWT，并进行高架十字迷宫实验（EPM）；

第3部分：选取18只小鼠随机分为3组，即hM4D+CNO组、hM4D+NS组、空载+CNO组，每组6只。hM4D+CNO组及hM4D+NS组向左侧vmPFC注射化学遗传学抑制病毒AAV2/9-CaMKIIa-hM4D(Gi)-EYFP，而空载+CNO组则注射空载对照病毒AAV2/9-CaMKIIa-MCS-3XFLAG-P2A-EGFP-WPRE。恢复7d后，对3组小鼠建立SNI模型。造模后14d，hM4D+CNO组及空载+CNO组腹腔注射CNO，而hM4D+NS组腹腔注射生理盐水，30min后检测右侧PWT；1h后进行高架十字迷宫实验。

动物模型

用1.5%异氟醚对小鼠进行持续吸入麻醉，待小鼠翻正反射消失、夹尾痛觉消失后，切开右后肢股骨外凹陷处皮肤，钝性分离肌组织，将坐骨神经主干及其3分支充分暴露。4-0丝线结扎胫神经及腓总神经，保留最细的腓肠神经，并沿结扎点远端剪断胫神经及腓总神经。假手术组（Sham）小鼠仅暴露坐骨神经主干及其3分支。逐层关闭手术切口，伤口常规涂撒青霉素钠粉末预防感染。

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脑区注射

吸入2%异氟醚诱导麻醉后，将小鼠固定于脑立体定位仪，1.5%异氟醚持续吸入维持麻醉，双眼涂红霉素眼膏。切开头部皮肤，暴露颅骨。去除颅骨表面软组织，充分显露前后囟。颅骨调平，取前囟向前2.25mm、旁开0.3mm、颅骨表面以下2.5mm作为vmPFC的坐标点。采用微量注射泵进行注射，第2部分实验中向左侧vmPFC注射红藻氨酸或生理盐水，第3部分实验中向左侧vmPFC注射化学遗传学抑制病毒（AAV2/9-CaMKIIa-hM4D(Gi)-EYFP）或空载对照病毒（AAV2/9-CaMKIIa-MCS-3XFLAG-P2A-EGFP-WPRE），注射速度为60nL/min，注射完毕留针10min，缓慢拔出。碘伏消毒颅骨表面及头皮伤口，将小鼠置于保温毯下待其苏醒，单笼喂养。

行为学检测

足底机械痛检测：小鼠预先在底部为0.5cm孔径铁丝网的透明玻璃箱（20cm×20cm×20cm）适应30min，用Vonfrey纤维丝垂直刺向小鼠右足底皮肤，刺激强度为0.02~2g。从0.4g开始，持续刺向足底4s，阳性反应为小鼠出现缩足或舔足动作，记录出现阳性反应的强度。共测量3次，间隔5min，取3次平均值作为所测得PWT。高架十字迷宫：将高架十字迷宫放置于VisuTrack动物行为分析系统的摄像头中央，喷洒70%酒精去除异味，调整照射光源的光强约为30lux，小鼠提前30min置于行为学检测房间适应环境。计算开臂以及闭臂的距离，选择观察区，定义开臂、闭臂、中心区，检测时间设置为6min。将小鼠轻柔放置于中心区，开始检测。计算小鼠进入开臂次数和开臂停留时间。

化学遗传学抑制vmPFC中CaMKIIa+神经元

造模后14d，AAV2/9-CaMKIIa-hM4D(Gi)-EYFP且腹腔注射CNO的SNI小鼠vmPFC中c-fos阳性神经元数量明显下降，此策略能明显抑制SNI小鼠诱导的锥体神经元过度活化。在vmPFC注射化学遗传学抑制病毒的SNI小鼠中，接受腹腔注射CNO小鼠的PWT、进入开臂次数及开臂停留时间相比于腹腔注射生理盐水的小鼠明显增加。CNO对vmPFC注射空载对照病毒的SNI小鼠不产生明显作用，相比于注射化学遗传学抑制病毒的SNI小鼠，其PWT、进入开臂次数及开臂停留时间明显降低。示例结果说明vmPFC中的锥体神经元能促进SNI小鼠的疼痛和焦虑样行为。

vmPFC中锥体神经元对SNI小鼠疼痛和焦虑样行为影响

A：vmPFC病毒注射模式示意图B：注射14d后vmPFC病毒表达情况C：注射病毒14d后各组vmPFC的c-fos表达情况D：注射病毒14d后各组损伤侧足底机械痛情况E、F：注射病毒14d后各组高架十字迷宫结果，与空载+CNO组比较。

参考文献：

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• Decosterd I, Woolf CJ. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain[J]. Pain, 2000, 87(2): 149-158.

• [11]Huang J, Gadotti V, Chen L, et al. A neuronal circuit for activating descending modulation of neuropathic pain[J]. Nat Neurosci, 2019, 22(10): 1659-1668.

• 林培敏,刘燕,刘婷,等.腹内侧前额叶皮质锥体神经元参与选择性坐骨神经损伤小鼠疼痛和焦虑样行为调控的研究[J].中国临床解剖学杂志,2023,41(05):557-564.