Dev Cell | 赵斌团队报道RIPK4相分离调控表皮分化的机制和功能

人和小鼠都有多层的表皮结构，在发育过程中由单层的外胚层细胞分化而来，发挥抵挡有害微生物和防止体液流失的屏障功能。具有干细胞性质的基底层细胞一边增殖，一边分化并向上迁移，在钙离子等生理信号刺激下，依次形成有棘层、颗粒层和角化层。 尽管表皮分层发育的形态建成过程已经被研究得相当透彻，但协调分化程序的分子机制还很不清晰 。 Hippo 通路在限制器官大小上发挥关键作用 。体外研究发现该通路感受环境机械信号和 GPCR 等介导的化学信号调控 ，并通过核心激酶级联MST1/2-LATS1/2 磷酸化 转录辅激活因子YAP/TAZ 来调控细胞增殖和凋亡、干细胞自我更新和分化等过程。然而，Hippo通路领域内悬而未决的重要问题是生理条件下，Hippo通路活性调控的信号来自哪里？机制是什么？

2025 年 6 月 25 日，浙江大学生命科学研究院赵斌和杭州师范大学郦莉实验室在Developmental Cell上在线发表了题为RIPK4 promotes epidermal differentiation through phase separation and activation of LATS1/2的研究论文。该研究 通过基因敲除和敲入小鼠、皮肤类器官等工具，阐明了表皮分化过程中RIPK4起始的非经典Hippo通路的调控机制，并揭示了相分离在细胞分化中的作用。

作者首先 通过筛选人类激酶文库 发现 RIPK4 是 Hippo 通路中 LATS1 的上游激酶。 RIPK4 的失活突变会导致人类发育综合征，其特征是表皮分化缺陷。因此，作者在角质细胞系中敲除了 RIPK4 ，发现可以 抑制分化条件下的 YAP 磷酸化和胞质转位，并阻断分化标志物的表达。而进一步使用siRNA或抑制剂干扰 YAP/TAZ 的活性则可以恢复角质细胞分化的过程。 在小鼠中敲除 Ripk4 模拟了人类遗传病的表型，在E18.5的皮肤中出现 颗粒层和有棘层的扩张，以及最外层角化包膜的缺失，被角化不全的有核细胞所取代。细胞增殖标志物 Ki67 显示其表达没有显著差异。然而，角化不全的细胞中出现基底层标志物 Krt 14 异位表达；颗粒层标志物 Loricrin 的染色证实了颗粒层的扩张；晚期分化标志物 Krt10 的表达在颗粒层和有棘层中都显著降低，这些现象证实了分化的缺陷。有趣的是，检测非磷酸化活性形式 Yap 和 Yap/Taz 蛋白定位发现 Yap/Taz 在颗粒层和角化不全层中异常激活，其中颗粒层最为显著。 通过 单细胞转录组和原代角质形成细胞体外分化模型 ， 作者发现 Yap/Taz 抑制 胆固醇生物合成， 而胆固醇及其衍生物是角质层的关键组分。在 Ripk4 敲除小鼠 表皮中 进一步敲除 Yap/Taz 可以部分恢复 皮肤屏障缺陷，尤其在背部中线皮肤明显可见重新出现角质层，并且甲苯胺蓝拒染实验显示皮肤屏障功能的恢复。 Yap/Taz 在背中线皮肤的作用 与 Ripk4 自身敲除影响表皮分化的解剖位置特异性相似。因此， Yap/Taz 是 Ripk4 调控表皮终末分化的重要效应分子。在本研究之前，有报道表明Ripk4可能通过磷酸化激活I nterferon regulatory factor 6 (I rf 6) 调控表皮分化。但与Ripk4不同，

Irf6

Yap/Taz

Ripk4

在机制上，作者首先通过免疫共沉淀发现 RIPK4 通过其激酶结构域与 LATS1 直接相互作用，并且可以直接磷酸化LATS1。然而，与其他已知的LATS1上游激酶不同的是，RIPK4不但磷酸化LAST1的 疏水基序，还磷酸化LATS1的激活环（ activation loop ）。这提示与经典的上游激酶MST1/2（即Hippo）相比，RIPK4对LATS1的调控可能存在额外的机制。作者注意到 外源表达的 RIPK4 在细胞质中分布不均，形成不同大小的凝聚体。活细胞成像等实验证实 RIPK4 凝聚体具有类似液体的特性。而RIPK4的液液相变是由其C端的10个 锚蛋白重复序列（ Ankyrin repeat , AR ）介导的。有意思的是，截短体实验显示，单个AR不足以介导RIPK4的凝聚体形成，而只要保留2个AR就可以促使相变发生，提示多价相互作用在RIPK4凝聚体形成中的作用。在Ripk4 N端敲入GFP-HA标签的小鼠中，内源 Ripk4 在Krt10标记的表皮分化层中具有大量凝聚体定位，并且这些凝聚体独立于透明角质颗粒。Ripk4的相变过程是否与调控LATS1活性相关呢？ 作者 发现 LATS1 与 RIPK4 的共表达导致 LATS1 被募集到 RIPK4 凝聚体。而 RIPK4 的AR截短突变显著减弱了磷酸化 LATS1 的能力。值得注意的是自磷酸化实验显示 AR 的缺失并未减弱 RIPK4 本身的激酶活性。这表明RIPK4通过将LATS1募集到相分离凝聚体中提高其局部浓度，进而促进RIPK4对LATS的磷酸化。为了进一步证明这一假说，作者将 一对多价相互作用的支架蛋白 —— 串联的 SUMO3 蛋白和串联的 SUMO 相互作用基序分别与 RIPK4 和 LATS1 融合，发现当混合纯化的重组蛋白时，不但能够形成共凝聚体，还能显著促进LATS1磷酸化。另外，在RIPK4的人类疾病突变体中，不但有直接突变激酶结构域导致失活的突变体，还存在提前终止导致C端AR结构域丢失的突变体，例如 S376X ，本研究揭示了这类突变体导致疾病的原因。

这一研究发现了RIPK4起始的非经典Hippo通路在表皮分化中发挥重要作用，并为Bartsocas-Papas综合征等遗传病的机理和治疗提供了新的思路。

赵斌实验室博士后曹晓磊为本文的第一作者。该工作得到了 沈立、冯新华、陆华松、宋海、叶存奇等合作实验室的支持。

https://doi.org/10.1016/j.devcel.2025.05.017

制版人： 十一

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