IgG 类双特异性抗体纯化的路线图

双特异性抗体（bsAbs）是可以结合同一目标或不同目标上的两个表位的抗体。它们能够同时靶向两个目标，从而实现新的作用机制（例如，双重抑制信号通路和招募效应细胞）。因此，双特异性抗体已成为治疗癌症和其他疾病的强大工具。近年来，处于研发阶段的治疗性双特异性抗体数量显著增加。

目前，双特异性抗体主要通过重组方法生成，并且已经开发出多种不同的形式。根据其形式，双特异性抗体可以大致分为两大类：包含Fc区的IgG样分子和缺乏Fc区的较小非IgG样分子。一般来说，IgG样双特异性抗体的生产技术难度高于无Fc区的对应物。根据其结构对称性，IgG样双特异性抗体可以进一步分为两大亚组：非对称双特异性抗体和对称双特异性抗体（图8.1）。每种亚组双特异性抗体的纯化通常都面临独特的挑战。在介绍IgG样双特异性抗体纯化的一般路线图之前，将简要回顾与每种亚组双特异性抗体相关的常见副产物及其去除方法。

非对称双特异性抗体

非对称双特异性抗体通常源自两种具有不同结合特异性的亲本抗体，因此包含四条不同的链：两条不同的重链（HCs）和两条不同的轻链（LCs）。当这些链在生产细胞中共表达时，需要不同抗原特异性的重链发生异二聚体化。此外，针对一种抗原的轻链必须与针对相同抗原的相应重链配对。然而，如果允许这四条链随机配对，错误组装的物种（例如，同二聚体、含有错误配对轻链的分子）可能占总质量的约90%。因此，已经开发出多种蛋白质工程技术以强制正确的链配对。其中，knobs-into-holes（KiH）和CrossMab技术是应用最广泛的两种方法，分别用于克服重链同二聚体化和轻链错误配对的障碍。然而，尽管这些方法设计精巧，但无法完全避免错误链配对。此外，链表达不平衡和次优培养条件可能导致其他副产物（例如，半抗体）。以下部分将简要介绍去除同二聚体和半抗体的方法。

同二聚体

一般来说，同二聚体难以去除，因为它们通常表现出与目标双特异性抗体相似的物理化学特性。有效清除同二聚体需要充分利用每种双特异性抗体设计的独特性。有些特殊设计使得同二聚体与异二聚体双特异性抗体的分离相对较为简单。由于不同设计的同二聚体表现出不同的特性，其去除方法将分别讨论。

采用knobs-into-holes技术构建的双特异性抗体

许多非对称IgG样双特异性抗体采用了knobs-into-holes技术来促进重链异二聚体化（图8.2A）。然而，尽管这种策略显著提高了异二聚体的形成，但同二聚体化仍可能在低水平（例如，5%）发生。特别是，与knob-knob同二聚体相比，hole-hole同二聚体更为常见，其形成受到knob的一定程度阻碍。因此，如果“hole”重链表达过量，同二聚体可能成为主要的副产物。

张等人最近发现，与knobs-into-holes设计稳定的异二聚体相比，hole-hole同二聚体在低pH条件下稳定性较低。在低pH条件下，hole-hole同二聚体会发生构象变化，变得更疏水。利用hole-hole同二聚体对低pH的高敏感性以及随后的构象/疏水性变化，可以促进其分离。在最近的一项研究中，我们发现，当在略低于通常使用的pH值（例如，pH 4.5，而不是pH 5.5）的条件下加载时，Capto MMC ImpRes能够提高hole-hole同二聚体与knobs-into-holes异二聚体之间的分辨率。此外，通过在洗涤和洗脱缓冲液中加入5%（体积分数）聚乙二醇（PEG）3350，可以进一步增强分辨率（作者未发表的工作）。这种方法对于去除采用knobs-into-holes设计的双特异性抗体中的hole-hole同二聚体副产物应具有普遍价值。

基于静电相互作用驱动异二聚体化的双特异性抗体

在CH3界面不同位置引入电荷置换是另一种促进重链异二聚体化的替代策略（图8.2B）。一般来说，将带有相反电荷的残基引入互补的CH3区域。异二聚体化受到吸引性静电相互作用的青睐，而同二聚体形成则受到排斥性电荷相互作用的阻碍。与knobs-into-holes设计中两种类型的同二聚体受到的抑制程度不相等不同，在静电导向的情况下，对两种同二聚体的抑制效果是均等的。

在一项研究中，作者发现，对于具有不同电荷置换的设计，异二聚体水平范围为87%至100%，表明这是一种促进异二聚体形成的有效方法。对于选定的设计，当两种重链以1:1的比例表达时，通常可以取得最佳结果。然而，两种同二聚体仍可能以少量产生，但可以通过阳离子交换（CEX）色谱法有效去除，因为同二聚体和异二聚体通常由于电荷置换而具有相当不同的电荷特性。

基于WuXiBody平台的双特异性抗体

WuXi Biologics最近开发了一种新的双特异性抗体平台：WuXiBody（图8.2C）。在一个Fab臂中，恒定区（CH1/CL）被T细胞受体（TCR）恒定域所取代。此外，通过非天然的链间二硫键增强了TCR α和β区域之间的相互作用。这种设计确保了相应的重链-轻链配对，并且当与knobs-into-holes技术结合时，可以大大解决双特异性抗体构建中的链错配问题。

TCR恒定域具有相对较低的等电点（pI），这一特性可用于促进同二聚体的去除。在基于WuXiBody格式和knobs-into-holes策略设计双特异性抗体时，最好将TCR域包含在“knob”半抗体中。此外，“hole”半抗体应略微过量表达。这样，主要副产物将是“hole”半抗体和hole-hole同二聚体。这两种副产物不含TCR域，因此其pI高于含有低pI TCR域的双特异性抗体。这种pI差异有助于通过阴离子交换（AEX）色谱法去除hole-hole同二聚体。例如，在适当的条件下，低pI双特异性抗体可结合到AEX柱上，而高pI的hole-hole同二聚体则不结合，留在流穿液（FT）中。

基于pI工程的重链双特异性抗体

pI工程是促进双特异性抗体纯化的一种有效手段。在此方法中，通过突变改变一条重链的pI值，以增加双特异性抗体与同二聚体副产物之间的pI差异。pI工程可应用于重链可变区或Fc区（图8.2D）。或者，可使用具有不同pI的不同亚类（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）的恒定区作为构成双特异性抗体的两条重链的恒定区（例如，将一种亲本单抗重链的恒定区替换为来自不同亚类的恒定区，以生成亚类杂交双特异性抗体）。增加的pI差异极大地有助于通过离子交换（IEX）色谱法纯化目标双特异性抗体。在最近的一项研究中，IEX色谱法使用pH梯度比使用盐梯度展现出更高的分辨率。作者表明，即使两种亲本抗体之间的pI差异非常小（即0.1个pH单位），也可以使用高度线性的pH梯度实现异二聚体与同二聚体之间的适当分离。

基于蛋白A结合能力废除的重链双特异性抗体

一种类似于pI工程的策略，也可有效简化同二聚体去除，即修改一条重链Fc的蛋白A结合亲和力（图8.2E）。在这种设计中，一个重链Fc结构域的蛋白A结合能力被废除（称为Fc*）。然后，双特异性抗体和两个同二聚体将分别包含FcFc和FcFc/FcFc*。由于蛋白A结合废除取代，双特异性抗体（FcFc*）应具有介于FcFc和FcFc同二聚体之间的中间结合亲和力，后两者分别表现出正常和严重降低的结合亲和力。已知人IgG3亚型不与蛋白A结合，因此源自人IgG3的Fc链是一种天然存在的Fc*。或者，可通过将野生型Fc CH3结构域中对蛋白A结合至关重要的残基替换为IgG3中的相应残基来生成Fc*。

由此产生的工程化亲和力层次结构有助于使用蛋白A色谱法将所需的双特异性抗体与同二聚体杂质分离。FcFc同二聚体不会结合，因此出现在流穿液中。双特异性抗体（Fc*Fc）和FcFc同二聚体都会结合，但亲和力不同：前者结合得不如后者紧密。弱结合的双特异性抗体可以在较不严格的pH条件下选择性洗脱，而在此条件下，紧密结合的FcFc同二聚体得以保留。通过在洗脱缓冲液中加入CaCl2或MgCl2，可以进一步改善双特异性抗体与FcFc同二聚体之间的分离。人们认为，通过调节抗体与蛋白A配体之间的疏水相互作用，可以实现改善的分辨率。

通用重链双特异性抗体 - kl体

采用通用重链的双特异性抗体设计完全避免了重链配对问题，双特异性由两条不同的轻链赋予：一条κ链和一条λ链（图8.2F）。在这种设计中，未引入任何突变或外源序列。除了所需的kl体外，当三条链（重链、κ轻链和λ轻链）共表达时，还会产生单κ和单λ同二聚体。然而，kl体的独特性质使得这两种杂质（κκ和λλ）能够通过依次使用KappaSelect和LambdaFabSelect树脂进行亲和纯化而易于去除，这两种树脂分别结合κ和λ轻链的恒定区。虽然双特异性kl体可以结合这两种树脂，但单λ和单κ同二聚体分别在KappaSelect和LambdaFabSelect的柱流穿液中被消除，最终得到纯化的kl体。尽管这两种亲和色谱的顺序可以互换，但如果一种单特异性物质的含量高于另一种（例如，如果单λ多于单κ，则KappaSelect应置于LambdaFabSelect之前），则最好先去除主要的单特异性物质，以便为靶kl体节省大部分柱的载样容量。

单链可变片段（scFv）-Fc

单链可变片段（scFv）是通过连接重链和轻链的可变区构建而成的，两者之间通过连接肽相连。作为一种避免重链-轻链错配的策略，一些双特异性抗体采用了Fab-scFv格式，其中一个Fab臂被scFv所取代。在这种设计中，需要共表达三条链（重链、轻链和scFv-Fc）以组装双特异性抗体。在某些情况下，scFv-Fc表达过量，成为主要的杂质。由于scFv-Fc包含Fc区，因此无法使用蛋白A亲和色谱法将其与目标双特异性抗体分离。然而，双特异性抗体和scFv-Fc之间的区别在于，前者含有轻链恒定区，而后者则没有。这一区别有助于使用替代的亲和树脂KappaSelect进行分离，该树脂特异性结合κ轻链的恒定区。虽然双特异性抗体可以通过其Fab臂与KappaSelect结合，但缺乏轻链恒定区的scFv-Fc则无法结合。这种方法为去除scFv-Fc单体和同二聚体提供了一种有效手段。值得注意的是，另一种κ轻链结合的亲和介质ProteinL树脂，它结合的是可变区而不是恒定区，因此无法区分scFv-Fc和双特异性抗体。由于scFv（单体和二聚体）可以通过KappaSelect轻松去除，因此在生产采用Fab-scFv格式的双特异性抗体时，最好让scFv的表达量略过量，以尽量减少含有正常Fab臂的同二聚体的形成，因为这些同二聚体可能难以去除。

半抗体

半抗体是双特异性抗体生产中的常见杂质。在某些情况下，它是由于有意过量表达无法形成同二聚体的重链而产生的。由于半抗体仅含有一个Fc结构域，因此其与蛋白A树脂的结合能力弱于含有完整Fc区的双特异性抗体。因此，在线性pH梯度洗脱时，半抗体会比双特异性抗体更早地从蛋白A柱中洗脱出来。通过在流动相中加入盐类，可以进一步改善半抗体与完整抗体之间的分辨率。根据线性pH梯度洗脱结果，可以开发出一种包含分步pH洗脱和中间pH洗涤的工艺。中间洗涤的pH值需要足够低，以洗脱半抗体，同时仍能保留结合在柱上的双特异性抗体。最佳洗涤pH值取决于装载密度。当柱子以低密度装载时应使用相对较低的pH值，而以高密度装载时应使用较高的pH值，以实现有效的半抗体清除和合理的收率。一般来说，由于这种工艺具有负荷敏感性，因此不够稳健。

羟基磷灰石（HA）是一种介导阳离子交换和金属亲和相互作用的混合模式树脂，它也可以在一定程度上分离半抗体和完整的双特异性抗体。一般来说，在线性盐梯度洗脱条件下，半抗体会比双特异性抗体更早地洗脱出来。在一个案例研究中，双特异性抗体的纯度从装载时的33%提高到洗脱液中的80%。在另一个例子中，双特异性抗体的纯度从77%提高到97%。Gagnon等人先前表明，在梯度起始和梯度结束缓冲液中加入5%至10%的聚乙二醇（PEG），可以显著提高HA的分辨率。因此，在存在PEG的情况下，可以预期半抗体和双特异性抗体之间能够实现更完全的分离。在线性梯度洗脱下的观察结果还表明，可以开发出分步洗脱工艺，并且通过选择合适的洗涤条件，可以实现半抗体的大量清除。

除了HA之外，另一种混合模式树脂Capto MMC在适当的条件下也可以很好地清除半抗体。Capto MMC具有阳离子交换和疏水基团。结合在柱上的蛋白质可以通过线性盐或pH梯度进行洗脱。一般来说，半抗体的结合能力弱于双特异性抗体，通常出现在早期洗脱分数中（作者未发表的工作）。根据线性梯度洗脱的结果，可以引入一个洗涤步骤，在分步洗脱过程中选择性地去除半抗体。

最后，如果半抗体的等电点（pI）与双特异性抗体的pI有显著差异，那么可以通过离子交换（IEX）色谱法实现这两种物质的分离。

对称双特异性抗体

对于采用对称格式的双特异性抗体，双特异性通常是通过在轻链或重链的任一末端融合第二个抗原结合单元来实现的。由于对称双特异性抗体是通过链延伸而不是引入不同的链来实现双特异性的，因此通常与非对称双特异性抗体相比，产生的副产物数量较少。然而，对称格式的双特异性抗体显示出显著增加的聚集倾向。在某些情况下，聚集物含量高达50%。聚集物可能是由于链长增加和柔韧性提高导致的分子间结构域交换而形成的。对于对称双特异性抗体，聚集物去除成为下游处理的主要任务。以下部分将分别介绍几种提供良好聚集物清除能力的色谱法。

蛋白A色谱法

一般来说，在典型条件下，蛋白A色谱法去除聚集物的效果不如一些替代色谱策略。尽管已知聚集物的结合能力比单体更强，但它们通常与单体共同洗脱，仅通过调整洗脱pH值通常不足以实现良好的分离。最近，我们开发了一种方法，可以显著提高蛋白A去除聚集物的能力，允许在捕获步骤中去除大部分聚集物。特别是，我们发现，在流动相中加入PEG/氯化钙或PEG/氯化钠组合可以显著提高单体与聚集物之间的分辨率。对于用于方法开发和演示的案例，优化后的程序可将聚集物从大于20%降低到大约3%至4%。这种方法减轻了蛋白A后抛光步骤的聚集物去除负担，并提高了下游工艺的整体稳健性。

疏水相互作用色谱法（HIC） HIC通常用于去除聚集物，并已被证明非常有效。HIC通常以流穿模式运行，用于此目的。聚集物通常比单体更疏水，可以选择适当的条件，使单体流穿，而聚集物结合。不同供应商提供的HIC树脂具有不同程度的疏水性。根据所使用的特定HIC树脂，需要调整装载中的盐浓度以获得最佳结果。例如，在一项研究中发现，对于相同的装载，使用中等疏水性的Phenyl 650 M HIC树脂时需要0.5 M硫酸铵，而使用高疏水性的POROS Benzyl UltraHIC树脂时只需要50 mM氯化钠。

Capto MMC ImpRes和Capto adhere色谱法

Capto MMC ImpRes是Capto MMC的分辨率改进版本。与Capto MMC相比，Capto MMC ImpRes的珠子大小和配体密度都有所降低，从而提高了单体与聚集物之间的选择性。根据供应商的应用说明，在pH 5.0至7.0和氯化钠浓度0至150 mM之间可以获得高结合容量，而在pH 5.0时可实现高纯度。在之前的一项研究中，我们发现，当使用氯化钠洗脱柱子时，可以获得良好的聚集物清除效果，但洗脱峰尾部显著。考虑到结合涉及疏水相互作用，这并不令人惊讶。通过使用精氨酸洗脱柱子，可以在不牺牲分辨率的情况下改善峰展宽，因为精氨酸可以破坏静电和疏水相互作用。

Capto adhere是另一种能够去除聚集物的混合模式树脂。其配体含有能够进行阴离子交换、疏水相互作用和氢键的基团。对于聚集物去除，Capto adhere通常以流穿模式运行。根据供应商的应用说明，聚集物清除受pH值、电导率和装载量的影响。一般来说，较高的pH值、较高的电导率和/或较低的装载量可实现更好的聚集物清除效果。如果在流穿模式下无法实现良好的聚集物去除，则可以尝试结合-洗脱模式。

HA色谱法

HA色谱法以其强大的聚集物去除能力而闻名。例如，一项研究表明，HA可将聚集物水平从超过60%降低到不到0.1%。HA是一种混合模式树脂，能够进行磷酸盐阳离子交换和钙金属亲和相互作用。这两种相互作用协同作用，但其中一种可能在特定蛋白质的保留中占主导地位。磷酸盐广泛用于洗脱，因为它可以破坏这两种相互作用。而氯化钠对金属亲和相互作用的影响则微乎其微。大多数抗体主要通过阳离子交换相互作用结合，聚集物的结合能力比单体更强。一般来说，使用固定磷酸盐浓度的氯化钠梯度洗脱比使用磷酸盐梯度可以获得更好的分辨率。先前的研究表明，当将PEG加入流动相中时，可以增强蛋白质在HA柱上的保留，且增强程度与蛋白质大小成正比，这表明PEG优先增强聚集物的保留，从而实现单体和聚集物之间更完全的分离。

阳离子交换（CEX）色谱法

阳离子交换色谱法广泛用于抗体纯化的抛光步骤。然而，在典型条件下，它对聚集物的分辨率能力有限。尽管聚集物通常比单体蛋白质结合得更紧密，但两种物质之间的分辨率通常较低，尤其是当聚集物为二聚体时（聚集物峰通常出现在单体峰尾部的肩部）。因此，为了实现足够的聚集物清除，必须牺牲收率。阳离子交换色谱法通常在酸性条件下运行，这与大多数抗体的等电点相距甚远。然而，最近的一项研究表明，碱性pH值的阳离子交换色谱法实现了改善的聚集物去除效果。我们在之前的一项研究中使用POROS XS和Capto SP ImpRes在酸性pH值下进行线性盐梯度洗脱时，发现单体和聚集物之间的分离效果较差。然而，当在洗涤和洗脱缓冲液中加入5% PEG 3350时，我们观察到两种树脂的分离效果显著改善。与HA色谱法的情况一样，PEG增加了蛋白质的保留，且这种效果的大小与蛋白质大小成正比。在PEG存在的情况下，聚集物结合得更紧密，主要出现在洗脱液中。

纯化路线图

通过总结前文提供的信息，我们绘制了图8.3所示的IgG样双特异性抗体纯化路线图。对于每种常见的副产物类型，都提供了一条或多条导向其去除的路径。对于特定类型的副产物，可以依次使用互补的纯化路径，以实现最佳的清除效果。例如，蛋白A和MMC都能去除半抗体，因此将它们结合起来应该能够更完全地去除这种副产物。同样，当蛋白A与MMC或HA色谱法结合使用时，可以预期实现更好的聚集物清除效果。

总结

一般来说，IgG样双特异性抗体是通过重新组装来自两种不同抗体的链或在现有抗体上附加一个抗原结合单元生成的，分别形成非对称和对称分子。非对称双特异性抗体的构建涉及多条不同的链，因此这种类型的双特异性抗体的表达通常会因随机链配对和链表达不平衡而伴随各种副产物。尽管已经开发出几种策略来促进正确组装，但无法完全避免副产物的形成。对称双特异性抗体的构建涉及较少的链，但这种类型的双特异性抗体由于链长增加通常会导致稳定性降低和聚集水平升高。对于任何格式的双特异性抗体，相关的杂质都给下游纯化带来了相当大的挑战。特别是，由于副产物的种类和相对含量因个案而异，很难开发出一种能够满足每种个体双特异性抗体纯化需求的平台方法。通过收集文献中可用的针对双特异性抗体特异性杂质去除的信息，我们生成了一个路线图，为双特异性抗体纯化提供了一般性指导。虽然双特异性抗体相关的副产物最终需要通过纯化过程去除，但解决双特异性抗体独特的杂质问题不应完全依赖于下游工艺。强烈建议在上游阶段（即分子设计、细胞系开发和细胞培养开发）进行优化，以减轻下游的负担。

对于非对称双特异性抗体，需要选择一种能够强制正确链配对的适当策略。此外，所选策略可以与一种促进分离的策略相结合，这为去除仍可能以少量产生的潜在副产物提供了一种有效手段。例如，在一项研究中，通过将knobs-into-holes技术与pI工程相结合，实现了高效率的异二聚体化（>90%）以及从同二聚体副产物中直接分离双特异性抗体。在另一个案例中，Skegro等人通过将促进重链异二聚体化的技术与非对称蛋白A结合策略相结合，实现了90%至95%的异二聚体高收率和稳健的同二聚体痕迹去除。对于对称双特异性抗体，对附加结构域和连接链的优化工程对于最小化聚集至关重要。例如，在IgG-scFv的情况下，通过在scFv部分引入VH-VL链间二硫键来稳定scFv部分，并调整连接scFv与其余分子部分的连接链长度，可以显著减少聚集物的量。

除了分子设计外，平衡各条链的表达对于良好的双特异性抗体收率至关重要。在某些情况下，链表达不协调可能导致副产物增加，从而降低正确组装的双特异性抗体的百分比。然而，另一方面，一项研究表明，轻链的轻微过量表达是有利的，因为它促进了双特异性抗体的组装，并避免了3/4抗体（缺少一条轻链的抗体）的产生。可能需要微调才能获得最佳结果。此外，培养条件也可能对最终的杂质特征产生影响。因此，在双特异性抗体的情况下，需要筛选更多的载体构建、质粒比例、小池和培养条件，以实现高生产力并降低产品相关杂质。

总之，尽管团队合作对于生产任何治疗性抗体都至关重要，但对于这种复杂性显著增加的双特异性抗体来说，尤其如此。在上游工作充分优化的情况下，本工作中提供的纯化路线图才能发挥其最大的作用。

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