补料分批和灌流生物反应器中的临时半乳糖-锰补料调节UDP-半乳糖池，以增强mAb糖基化均质性

在生物治疗药物界，单克隆抗体（mAb）堪称 “扛把子”，几乎占据了市场的半壁江山。这些 “糖蛋白大佬” 在诞生后，还会经历一场名为 “翻译后修饰” 的变装秀，其中最引人注目的节目就是 N - 链糖基化。这场变装秀可不简单，直接影响着抗体的 “颜值”（结构）和 “战斗力”（功能特性）。

糖基化这位 “神秘嘉宾”，自带异质性属性，它要是发挥不好，治疗性糖蛋白的 “保质期”（稳定性）和 “药效”（临床疗效）都得遭殃。也正因如此，它被业内人士奉为 mAb 产品的 “黄金标准”—— 关键质量属性（CQA）。

咱们对中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的糖基化 “生产线”，以及细胞培养液里那些 “化学小助手” 怎么影响最终产品的 N - 糖基化 “菜单”，已经有了不少研究成果。不过尴尬的是，这些成果大多是基于生产结束后，对最终累积糖基谱的 “考古式研究”。要是能知道 N - 糖基化在生产过程中的 “七十二变”，以及 mAb 糖型组成如何 “见招拆招”，实时应对生产变化，那可就能打造出超智能的集成过程模型，让糖基化乖乖听话，生产出更 “完美无瑕” 的产品啦！

带着这个 “野心”，我们开启了一场探索之旅，研究特定营养补料培养基添加物，比如半乳糖、锰这些 “神奇调料”，还有补料时间这个 “神秘闹钟”，究竟会怎么 “折腾” N - 糖基化途径，从而调控赫赛汀生物仿制药单克隆抗体 ——曲妥珠单抗的 N - 糖基化。为了掌握一手情报，我们搬出了 N-GLYcanyzer 过程分析技术（PAT）这个 “高科技侦探”，在实验室规模的生物工艺里，以近乎实时的速度，紧盯补料分批和灌流模式下的糖基化 “嫌疑人”，就为了搞清楚单克隆抗体 N - 糖基化的 “时间魔法”，到底怎么被特定培养基添加物 “操控”。

这一研究，还真发现了不少 “内幕”！原来曲妥珠单抗的末端半乳糖基化，对培养基补料时间和细胞内的核苷酸糖池这两个 “幕后大佬” 特别敏感。时间分析就像一部悬疑剧，在葡萄糖紧缺的补料分批培养 “片场”，单半乳糖和双半乳糖 “主演” 的糖基化形式，产量随着时间不断 “加戏”。更有意思的是，不管是补料分批这种 “营养吃紧” 的模式，还是灌流这种 “营养管够” 的模式，半乳糖基化的 “剧本” 居然有不少相似之处。

简介

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞堪称 “顶流明星”！由它生产的单克隆抗体（mAb）稳坐市场 “头把交椅”，不仅牢牢占据绝大部分江山，每年还保持着 “稳如老狗”的增长率。这边厢，新药像 “雨后春笋” 般不断获批上市；那边厢，老款 mAb 专利一到期，生物仿制药市场就开始 “疯狂上分”。为啥 CHO 细胞这么 “牛”？因为它掌握着 “人源化变装术”，能进行 N - 链糖基化这类超厉害的翻译后修饰，妥妥的 mAb 生产 “理想型表达系统”。

说到 N 链糖基化，它就像给单克隆抗体做 “精致美容”，把特定寡糖（N - 糖）贴到抗体 Fc 区蛋白质骨架的天冬酰胺残基上。可别小看这一贴，N - 糖会直接影响抗体的 “工作业绩”，从稳定性到药效学、药代动力学，方方面面都得受它管。在哺乳动物细胞里，糖蛋白合成简直是一场 “大型团战”，内质网和高尔基体里的糖基化酶组成复杂网络，相互配合。而且糖基化途径还特别 “敏感”，细胞代谢一有风吹草动，分泌的单克隆抗体就会出现 “花式糖基化”。生物工艺里那些 “小调皮”，比如溶氧、pH 值、温度和搅拌速率一变化，也会 “捣乱”，改变最终的糖谱。所以啊，在上游阶段找出关键工艺参数和关键材料属性，就像给药物质量 “上保险”，毕竟它们直接决定了药物的关键质量属性，比如 N - 糖基化。

N - 糖链附着在 mAb 蛋白上，就像给抗体贴上了独特 “标签”，通过末端糖类就能区分，还直接影响药物的临床效果。有些 mAb 没了岩藻糖基化，反而因祸得福，和 FcγRIII 受体 “贴贴” 更紧密，让抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）直线上升。末端半乳糖分支则像个 “小助推器”，增加与 C1q 结合活性，把补体依赖性细胞毒作用（CDC）拉满。末端唾液酸是 “持久续航小能手”，能延长血清停留时间、调节抗炎活性。高甘露糖异构体就有点 “坑队友” 了，容易和血清甘露糖结合凝集素 2 勾搭上，激活凝集素补体途径，加速自身在体内的清除。正因为不同糖基化形式对 mAb 疗效影响巨大，N - 链糖基化妥妥成了关键质量属性，得全程 “重点盯防”。

科学家们为了调控单克隆抗体的糖基化谱，开启了 “花式操作” 模式。他们发现，给 CHO 细胞的营养培养基里加点 “神奇调料”—— 能影响特定代谢途径的补料添加物，就能改变 mAb 产品的糖基化谱。比如半乳糖、尿苷和锰，这些都是调节半乳糖基化的 “得力干将”。Gramer 团队像 “美食家” 一样，用不同剂量的尿苷、锰和半乳糖给细胞 “投喂”，发现 mAb 半乳糖基化速率跟着剂量 “水涨船高”，最后甚至 “吃到饱”。Kildegaard 团队更 “狠”，只用 20mM半乳糖补料，就给 mAb 半乳糖基化带来了 “统计学暴击”。Sha 团队则另辟蹊径，用半乳糖补料替换葡萄糖，靠着细胞内 UDP - Gal 浓度上升，成功提升了半乳糖基化速率。不过，有些研究想靠增加末端半乳糖聚糖种类来提升唾液酸化，结果发现唾液酸转移酶成了 “拦路虎”，根本行不通！

除了这些 “专业选手”，还有些不直接参与糖基化途径的化学调节剂也来 “凑热闹”。丁酸钠这位 “组蛋白去乙酰化酶抑制剂”，能让细胞多产单克隆抗体，却被发现细胞特异性生产率和糖基成熟度成反比，简直是 “鱼和熊掌不可兼得”。迷迭香酸最近也来 “试水”，虽然能提高单克隆抗体滴度，但对糖基化有没有影响，目前还是个 “未解之谜”。

在补料分批和连续灌流工艺里，营养补料对 N - 糖基化的 “时间魔法” 一直是科学界的 “老大难” 问题。为啥搞不清楚？还不是因为缺了实时监测的 “神器”—— 集成过程分析技术（PAT）！不过别慌，我们带着 N - GLYcanyzer PAT 系统闪亮登场啦！我们先用这个 “神器” 研究补料方案，以及半乳糖和锰补料对曲妥珠单抗在 CHO 细胞里的过程和 N - 糖基化谱的影响，在补料分批和灌流生物反应器里反复 “折腾”，就为了搞明白半乳糖利用率和各种营养物添加对单克隆抗体糖基化的影响。后续在灌流模式里，还用 N - GLYcanyzer 系统紧盯单克隆抗体 N - 糖基化谱的 “一举一动”，看它对持续营养物补料有啥反应，誓要揭开 N - 糖基化时间影响的神秘面纱！

方案 1：补料分批培养和灌流培养研究概述。对于补料分批实验，培养物每日（每24小时）或隔日（每48小时）补料，并添加葡萄糖（对照组）或葡萄糖和半乳糖（添加组）。对于添加组，在第一天补料时添加锰至1 µM。灌流实验则使用基础培养基或添加了半乳糖（1.8 g/L）和锰（1 µM）的基础培养基进行灌流。我们将对单克隆抗体糖基化和半乳糖基化调控进行时间分析，以了解补料和补料方案的影响；数值将根据半乳糖基化指数 (GI) 和分离的糖型进行评估。

详细实验操作和结果，请参考原文。

灌流生物反应器培养

在一个 5L 的玻璃生物反应器里上演，这玩意儿堪称细胞们的 “五星级酒店”，而它的 “智能管家” 就是赛多利斯家的 Biostat B-DCU 控制器，主打一个贴心服务。不过细胞们住得宽敞，实际使用面积也就 2L，相当于给它们划分了专属“豪华套间”。

在细胞们 “拎包入住” 前，咱可是做足了准备工作。把 “房间温度” 精准控在 37°C，妥妥的人体舒适体温，“室内 pH 值” 也稳定在 7.1，主打一个宜居环境。至于 “氧气供应”，直接给拉到设定值 50%，这待遇，比人类住的地方还讲究！要是 pH 值不听话，要么给它 “吹点二氧化碳” 降降温，要么用 0.5M 的 NaOH 快速 “中和一下脾气”，总之必须让环境时刻保持完美。

细胞大军入场时，初始密度是 0.5×10⁶ cells/mL，这相当于给反应器里来了一场 “细胞大迁徙”。为了让细胞们住得舒服，还安排上了 Repligen 家的 “高端设备”—— 配备 0.2µm 中空纤维过滤器的 XCell ATF 2 不锈钢装置，开启稳态灌流模式，这就好比给细胞社区装上了一套超牛的 “水循环系统”。

从第 4 天到第 8 天，“换水速度”（置换速率）从每天 0.25 个容器体积，一路猛增到 1.0 个容器体积，这速度变化，细胞们估计都得感慨：“这是要带我们体验速度与激情啊！” 后面就一直保持 1VVD 的 “换水节奏”，直到收获日，主打一个稳定输出。而且流出速率还能根据滤液速率灵活调整，就像给细胞社区安排了个智能管家，保证整个培养期间 VVD 和活细胞密度稳稳当当，主打一个 “岁月静好”。

每天都得给细胞们做 “体检”，采集离线样本分析各种培养参数，看看它们吃得好不好，住得舒不舒服。更绝的是，还用上了 N-GLYcanyzer PAT 系统，每天在线分析滴度和聚糖，这简直就是给细胞们安排了 24 小时的 “私人医生”，全方位监测健康状况！这场细胞生存游戏，就问还有谁能比它们过得精致？

结果与讨论

补料分批培养性能

本研究旨在探究添加半乳糖作为添加碳源如何随时间推移影响单克隆抗体（mAb）的产量和N-链糖基化。我们研究了补料（葡萄糖或葡萄糖加半乳糖）的添加情况，并将补料时间调整为每日（24小时）或隔日（48小时），以了解其对CHO细胞培养以及单克隆抗体产量的影响。在首次补料时，向添加了半乳糖的培养物中添加1 μM锰，以进一步提高相对糖基化水平。

所有条件下的活细胞密度 (VCD) 影响所有培养物的峰值活力和寿命。每日补料的培养物的峰值密度高于仅隔日补料的培养物（图 1A）。使用两种补料策略的每日补料对照培养物的峰值 VCD 为 26.6 × 10^6 cells/mL，而隔日对照和添加培养物的峰值 VCD 分别为 22.8 × 10^6 cells/mL 和 24.3 × 10^ 6cells/mL。配对t 检验显示，补料时间（每日与隔日）之间存在统计学意义，但对照组和添加组之间无统计学意义。基于这些结果，可以推断，补料时间对峰值VCD 的影响比添加半乳糖作为次要碳源的影响更大。从培养寿命来看（图 1B），所有细胞培养条件均能存活至第 10 天，细胞活力均高于 70%，一旦细胞活力降至此阈值以下，即可收获。

图 1. 补料分批培养工艺性能指标总结。活细胞密度（A）、活力（B）、氨含量（C）、乳酸含量（D）、葡萄糖含量（E）、葡萄糖消耗率（F）、半乳糖含量（G）和半乳糖消耗率（H）。

细胞在 “干饭” 这件事上，可太有自己的想法了！来看这场补料方案大比拼，不同补料策略下的氨生成趋势，前期堪称 “复制粘贴”，但到第 7 天就开始 “分道扬镳”（见图 1C）。每日补料的培养物，在第 4 天左右直接把氨浓度 “卷”到了峰值，对照组和添加组也不甘示弱，齐刷刷让氨浓度飙到了约 2g/L，这波操作堪称 “默契十足”。不过，热闹过后，氨浓度又乖乖回落到约 1g/L，至于两组之间，愣是没比出个高低，主打一个 “势均力敌”。

再看隔日对照和添加组，氨浓度在第 4 天率先发力，分别冲到 2.23g/L 和 2.31g/L 的小高峰。谁能想到，接下来剧情大反转，氨浓度先 “躺平” 到第 7天，又突然 “打鸡血” 一路飙升，到第 10 天，隔日补料对照组直接把氨浓度拉到 5.31g/L 的 “天花板”，而隔日添加组稍逊一筹，峰值为 4.13g/L。这氨浓度一路高歌猛进，其实是细胞在疯狂 “喊救命”—— 代谢压力山大，氨基酸代谢尤其是丙氨酸代谢，早就乱成了一锅粥！隔日补料培养的细胞外丙氨酸，好不容易在 3mM 达到人生巅峰，结果转头就开始 “走下坡路”。反观每日补料培养，丙氨酸浓度跟开了挂似的，一路涨涨涨，到第 10 天，每日对照培养和添加丙氨酸的培养分别达到 5.5mM 和 4.1mM，简直是 “没有最高，只有更高”。要说为啥会这样？可能每日补料培养的细胞掌握了 “独家秘方”，把细胞内的氨和丙酮酸转化成丙氨酸，妥妥的氨解毒 “小能手”！

再唠唠乳酸产量（见图 1D），补料日之间的乳酸浓度变化，简直像在跳 “同步舞”，第 5 天一起冲到峰值，随后集体 “画风突变”，开始消耗乳酸。每日对照和添加补料的乳酸产量，在第 5 天携手拿下 3.5g/L 的 “高分”，之后就一路 “跌跌不休”。隔日补料培养物就比较 “含蓄” 了，第 5 天的乳酸峰值浓度只有 2.77g/L，之后更是 “佛系”，乳酸水平一路走低，到第 8 天就 “躺平”，一直维持在低位。要说乳酸产量为啥有这差异？还得怪葡萄糖补料速率！隔日补料培养物的葡萄糖补得不够勤，导致葡萄糖水平比每日补料培养物低一大截，逼得细胞只能 “另辟蹊径”，默默完成代谢转换，简直是 “生活所迫” 啊！

葡萄糖和半乳糖的补料分批消耗

为了搞清楚葡萄糖和半乳糖在 “吃货细胞” 眼中谁更受欢迎，我们给培养物安排了严格的 “控糖计划”—— 每天或隔天把葡萄糖含量精准卡在 5 g/L，妥妥的细胞界 “减肥食谱”。至于半乳糖这位 “新选手”，我们按照 3:10（半乳糖：葡萄糖，质量比）的比例 “投喂”，这个配方可是从海量文献里 “抄作业” 得来的，堪称学术界认证的 “黄金比例”。锰元素也来凑热闹，第一天就给培养物加了 1 μM 锰，这剂量同样是 “抄文献作业” 的成果。

翻开图 1E，就像打开了细胞 “干饭日记”。上面那张记录着隔日补料时细胞外葡萄糖浓度，下面那张则是每日补料的 “干饭数据”。在隔日补料组，第 4 天才迎来第一次 “加餐”，此时对照组葡萄糖浓度只剩 1.63 g/L，加了 “神秘配方” 的培养组稍微 “富裕” 点，还有 1.77 g/L。结果刚补完料，葡萄糖就被细胞们 “暴风吸入”，光速清零。第二次补料前，对照组葡萄糖浓度掉到 0.33 g/L，加了添加物的还有 0.92 g/L 存货，这差距估计得 “归功” 于半乳糖这个 “替补碳源”。再看葡萄糖消耗率，隔日补料组简直是 “复制粘贴” 模式，没啥明显变化（图 1F）。不过和每日补料组比起来，隔日组前 4 天明显是 “饿坏了”，干饭速度更快。每日补料组在第 3 天开启首次 “投喂”，这时对照组葡萄糖剩 3.5 g/L，加了半乳糖的组稍少点，有 3.3 g/L。虽然数据上有点小差异，看着像是半乳糖让细胞对葡萄糖 “食欲减退”，但这点差距实在不够看，说不定是后期乳酸 “乱入”，搅乱了干饭节奏。不过总的来说，结果和之前研究 “撞衫”，还挺合拍。

半乳糖在培养物里堪称 “摸鱼大师”，悄咪咪就积累起来了（图 1G）。刚加进去的 24 小时，消耗速度快得像 “百米冲刺”，之后就开始 “躺平”，越来越慢（图 1H），估计是一开始浓度 “爆表”，细胞们干饭都带劲，后面吃撑了就懈怠了。两种培养条件下，半乳糖消耗率都在 20 到 40 pg/cell/day 之间徘徊。更有意思的是，每日补料组的消耗率像 “慢性子”，慢慢悠悠达到稳定；隔日补料组则是补料时 “狼吞虎咽”，补料间隙就 “细嚼慢咽”。这些 “戏精”般的变化，又和之前研究对上了暗号 —— 半乳糖消耗率果然是 “剂量控”，浓度越高越能激发细胞的 “干饭魂”，直到 “吃饱” 为止。

补料分批培养生产力

研究了单克隆抗体滴度和生产率，以了解补料方案和添加物的影响。所有培养物均在第9天左右达到峰值滴度，随后几天反应器内的滴度下降（图 2A）。这种损失可能是由于蛋白质降解造成的。每日补料培养物的峰值滴度分别为1.12 g/L（对照组）和1.23 g/L（添加物组）。隔日补料样品的峰值滴度分别为1.11 g/L（对照组）和1.19 g/L（添加物组）。配对比较图分析未显示这些培养物在峰值滴度方面存在任何统计学意义。这可能是由于营养限制造成的，因为在所有培养物中，细胞外天冬酰胺在第 6 天就已耗尽，天冬酰胺是一种已知影响 CHO 细胞中mAb 生产的关键氨基酸。

图 2. 补料分批培养的生产力、糖指数和糖前体。单抗滴度 (A)、单抗特异性生产力 (B)、相对累积半乳糖基化 (C)、相对累积甘露糖基化(D)。图中展示了胞内 UDP-葡萄糖 (E) 和 UDP-半乳糖 (F) 核苷酸糖池，它们是单抗糖基化的前体。

来看看这场细胞界的 “生产效率大比拼”！在对比细胞特异性生产率（见图 2B，此处应有聚光灯！）时，不同补料方案之间那可是暗藏玄机，上演着一出跌宕起伏的 “职场大戏”。

前 6 天，隔日补料培养的 “选手们”（对照组和添加组）堪称 “卷王本王”，它们的平均细胞特异性 mAb 生产力一路 “狂飙”，把每日补料培养组远远甩在身后。不过有趣的是，对照组和添加组这两位 “选手” 虽然表面上你追我赶，实际一查数据，根本就没拉开差距！这就好比班级里两个同学天天暗自较劲比成绩，结果一考试总分一模一样，也就是说，添加半乳糖和锰这俩 “辅助道具”，压根没给 mAb 生产率加 buff，那些细微的生产效率差别，全是补料时间在 “搞事情”。

再说说葡萄糖这位 “关键先生”，在隔日培养中，它的浓度被稳稳控制在 5g/L，就像一位尽职尽责的管家，把一切安排得明明白白，完全不用担心葡萄糖耗尽会突然 “罢工”，打断 mAb 的生产流水线。Fan 等人之前研究过葡萄糖饥饿对 mAb 生产力的影响，发现这俩简直是 “死对头”，葡萄糖越缺，mAb 生产力越不给力。不过神奇的是，轻微的 “挨饿” 对 mAb 生产力来说就是小 case，这和我们研究的结果简直是 “英雄所见略同”，妥妥的 “科学界的默契担当”！

补料分批单克隆抗体糖基指标

细胞里的糖类 “八卦” 可太精彩了！我们一顿操作猛如虎，根据观察到的各路糖型的 “出场频率”，算出了两个超重要的 “糖类 KPI”—— 半乳糖基化指数（GI，见图 2C，它就像半乳糖的个人业绩表）和甘露糖基化指数（MI，见图 2E，甘露糖的 “功劳簿”）。这些数值可是糖类们日日夜夜 “打卡” 累积的 “工作成果” 哦！

再来说说方案 2 里藏着的细胞 “糖类加工厂” 大揭秘！这工厂里，糖酵解、Leloir 途径和糖基化组成了一个 “你中有我，我中有你” 的复杂朋友圈。葡萄糖就像个 “打工人”，一进细胞就一头扎进糖酵解车间，吭哧吭哧工作，产出的能量一部分送去 TCA 循环 “发电站”，一部分支援蛋白质 “生产部”。半乳糖也不甘示弱，风风火火地进入细胞，通过 Leloir 途径 “安检口”，再顺着葡萄糖 - 1 - 磷酸 (Glc - 1 - P) 这条 “传送带” 溜进糖酵解车间。不过这半乳糖可是个 “多面手”，一部分还偷偷跑去生产 UDP - 半乳糖 (UDP - Gal) ，这可是制作聚糖的 “原材料”，专门用来打造半乳糖基化的 mAb “豪华产品”。

方案底部还曝光了糖基化 mAb 的 “跨国旅行” 路线！它们从内质网 (ER) 出发，坐着 “细胞航班” 前往高尔基体。刚到高尔基体，就被 “化妆师” GlcNAc 拉去给壳二糖核心 “化妆”，接着还要经历从 Man8 到最终 G0 或 G0F 的 “变形计”。等变完身，这些 “时髦精” 瞬时物种，要是碰上带着锰 “魔法棒” 的半乳糖基转移酶（比如 B4GALT），就会被 “点石成金”，加上半乳糖 “装饰”，瞬间华丽升级！

方案2. 葡萄糖和半乳糖代谢的相互关联。该图简要描述了葡萄糖转运至糖酵解（上图），以及半乳糖转运至Leloir途径（中图），该途径分支至糖酵解和糖基化途径。图下方描绘了mAb N-糖基化途径，该途径旨在产生更成熟的糖基形式，例如此处所示的G1F变体。

实验一开始，在第一次加料前就取了样，结果发现第三天时，两种培养物里的 MAb 半乳糖基化竟然没啥 “胜负之分”，跟约好了似的，一点统计学意义都没有，这开局还挺平平无奇。

但接下来剧情开始反转！加了半乳糖的培养物和对照组的 GI，那走势简直像失散多年的 “双胞胎”，趋势一模一样。到第 10 天，每日补料对照组的 GI 是 23.7%，比隔日补料对照组的 34% 低了差不多 10%，这差距，仿佛隔日补料组偷偷开了 “小灶”！

再看加半乳糖又加锰的培养物，直接上演逆袭戏码！和只加葡萄糖的对照组相比，它的半乳糖基化率 “蹭” 地一下就上去了，太猛了！每日补料的样品 GI 是 55.5%，隔日补料的更夸张，直接飙到 69.1%，比每日补料多了 13.6%。看来在提高半乳糖基化这事上，隔日补料策略堪称 “王者”，每日补料只能 “甘拜下风”。为啥加半乳糖这么好使？原来是它能通过 Leloir 途径，让 UDP-Gal 的生物合成疯狂 “充值”，在培养前期，UDP-Gal 水平和相对 GI 就像 “最佳拍档”，携手共进。虽然隔日补料组的 mAb 生产力已经很优秀了，但 UDP-Gal 池和半乳糖基转移酶活性这俩 “神助攻”，直接把 mAb 的半乳糖占据率又往上拉了一大截。这结果，和 Fan 等人研究葡萄糖饥饿的实验简直是 “英雄所见略同”，高和严重葡萄糖饥饿的培养物 GI，比低饥饿和非饥饿组高得多，妥妥的 “饥饿出奇迹”！

再瞧瞧甘露糖基化这边，除了隔日补料对照组，其他培养物的相对累积甘露糖基化水平都 “乖巧” 得很，低于 3%。加了半乳糖和锰后，两种补料方案的 MI 指数直接 “躺平” 下降，隔日补料对照组降到 2%，每日补料对照组更 “佛系”，只有 1.6%。没加这俩 “神奇组合” 时，每日补料对照组 MI 是 2.5%，隔日补料对照组却 “独树一帜”，达到 4.5%，差距显著。这甘露糖基化增加的 “锅”，得让隔日对照组里积累的高浓度氨来背，它和 UDP-GlcNAc 池较低脱不了干系。

最后看看隔日补料对照组的 UDP - 葡萄糖（UDP-Glc）池，每次加料后，它的水平就像坐过山车一样 “咻” 地冲上去，可到第 7 天后又 “唰” 地降下来，UDP-Gal 水平也跟着 “凑热闹”。看来这些核苷酸糖 “不安分”，不好好搞糖基化，跑去其他代谢途径 “玩耍” 了，从对比隔日和每日补料对照组的核苷酸糖池和 MI 也能发现这点。都说培养基里葡萄糖浓度低，会让聚糖成熟的 “原料”不够，看来和 UDP-Glc 水平还真是 “难兄难弟”，关系密切得很呢！

补料分批培养中糖基化的时间变化

为了搞清楚补料分批培养这出大戏里糖基化是咋随着时间 “整活” 的，我直接化身 “糖分精算师”！每天吭哧吭哧算相对糖异构体数量，这计算过程跟算自己每月零花钱花在哪了似的，全靠每日积累速率。算完这个还不够，我又根据加权平均值的 “神秘走位”，算出了滴度，都给它画到图 3 里，方便围观这些数值的 “日常行为”。

不过我这计算可不是永无止境的，算到培养第 9 天就收手了，为啥？因为这天滴度达到 “人生巅峰”，后面就开始走下坡路，像极了熬夜追剧后第二天的精神状态。还有那些唾液酸化物种，我干脆没让它们在报告里 “露脸”，为啥呢？因为它们每天的糖基化速率就跟佛系打工人似的，一点波澜都没有，毫无 “表演欲”。

再说说这些不同的糖型，好家伙，它们的变化趋势简直是 “复制粘贴” 了累积糖指数值的剧本。那些加了半乳糖和锰的培养物，里面的半乳糖基化物种就跟发现宝藏似的疯狂增加，而 G0F-GlcNAc 和 G0F 这些 “非主流” 瞬时和截短物种，只能默默减少，仿佛在这场糖分竞争中败下阵来，灰溜溜地退场。

图3. 补料分批培养的相对每日糖型产量。此处显示了主要的mAb糖型。唾液酸化糖型种类被省略，因为它们的产量几乎没有变化。

这些抗体糖型们在培养皿里的 “奇幻漂流”！先看截短的 G0F-GlcNAc 同工型（图 3A），这小家伙堪称 “佛系代表”，在各种环境里都稳稳把自己的 “存在感” 控制在 1% - 2%，简直是 “躺平界楷模”。但遇到每日补料这一 “豪华套餐”，立马支棱起来，存在感飙升到约 4%，看来也是个 “干饭积极分子”。

再看 G0 同工型（图 3C），就像 “电量不足的手机”，随着培养时间流逝，丰度持续走低。不过，隔日补料方案堪称 “省电模式”，比每日补料更能让它 “低调做人”，丰度降得那叫一个明显。

要说 mAb 里的 “人气王”，非 G0F 莫属（图 3D）。在每日补料对照方案下，它就像粉丝暴涨的 “网红”，热度蹭蹭往上涨；但在隔日对照里，后半段培养时间，它的每日相对丰度就开始 “走下坡路”，人气大不如前。G0F 糖型在培养过程中总爱 “野蛮生长”，我们推测它在迈向半乳糖基化的路上，遇到了个 “拦路虎”—— 工艺瓶颈。不过别怕，半乳糖和锰这对 “黄金搭档” 一出手，瓶颈立马 “矮半截”。在每日添加培养里，G0F 糖型到第 5 天就 “躺平发育”，稳定分泌约 40%。可跟隔日添加培养比起来，它就像泄了气的皮球，一路下跌，到第 9 天相对丰度直接跌破 20%。这说明在隔日补料的 “艰苦环境” 里，葡萄糖不够用，半乳糖只能 “含泪转行”，放弃能量代谢，一门心思投入到半乳糖基化 mAb 的生产大业中。隔日补料时添加半乳糖后 GI 的增加（图 2C），就是它 “转行成功” 的铁证！

把目光转向半乳糖 mAb 异构体，这里藏着半乳糖基化率的 “小秘密”。像 G1（图 3E）、G1'（这位 “神秘嘉宾” 没出镜）、G2（图 3F）这些 “小透明”异构体，因为丰度低，它们的细微变化就像 “躲猫猫高手”，很难被我们发现。但 G1F（G1 (α1-6) F）和 G1F'（G1 (α1-3) F）（图 3G、H）就有意思了，它们和 G0F 异构体玩起了 “跷跷板游戏”，G0F 减少，G1F + G1F' 就增加，这说明半乳糖和锰这对 “CP” 一发力，抗体的半乳糖基化水平就直线上升。没添加的培养物里，双半乳糖聚糖异构体 G2F 产量虽然不高，但胜在稳定（图 3I）。每日添加培养时，G2F 异构体开始 “逆袭”，后半段培养时间里，每天都稳定产出约 8 - 10% 的相对丰度。而在隔日添加补料方案下，G2F 直接开启 “暴走模式”，到第 9 天产量逼近 20%。这下终于明白为啥隔日和每日添加样品的 GI 不一样了，原来是 G2F 糖型在 “暗中发力”！不过，唾液酸化却对补料间隔 “无动于衷”，看来在唾液酸转移酶活性这一块，还藏着另一个 “顽固瓶颈”。好在锰和半乳糖这俩 “外援” 对唾液酸转移酶没影响，而且曲妥珠单抗本身就 “不爱” 唾液酸糖基形式。

最后再说说高甘露糖异构体 Man5（图 3B），这简直是个 “高冷选手”，半乳糖和锰的加入，在它眼里就跟 “过眼云烟” 似的，完全不影响它的每日相对丰度。对比每日和隔日补料方案对照，每日补料培养物里 Man5 的丰度和添加培养物差不多，都在 2% - 3% 之间徘徊。但隔日补料对照组的 Man5 从第 7 天开始 “突然发力”，到第 9 天直接 “冲上巅峰”，达到约 6.5%。这高甘露糖种类的增加，暗示糖基化代谢可能 “压力山大”。大胆猜测一下，在隔日补料方案里，细胞外葡萄糖第 5 天就 “见底”，葡萄糖代谢只能 “先保命”—— 产生能量，顾不上 mAb 糖基化了。

灌流培养性能

为了搞清楚糖基化的 “神秘走位”，咱们开启了灌流培养模式！和补料分批培养不同，这里的营养物质简直是 “自助餐无限量供应”，主打一个敞开了吃！

两种培养方式就像双胞胎兄弟，开局很相似。对照组用的是 HIP-CHO 培养基，而“豪华加料组” 则是在 HIP-CHO 培养基（内含 6g/L 葡萄糖，这葡萄糖量，细胞看了都直呼 “管饱”）的基础上，又大手一挥加了 1.8g/L 半乳糖和 1µM 锰。这葡萄糖和半乳糖的配比，那可是精准复刻了补料分批研究里进料的黄金比例！

一开始，两种培养都按批次培养的老路子走，直到反应器里的葡萄糖浓度 “瘦身” 到 2g/L 及以下，重头戏灌流模式才闪亮登场，给生物反应器里的细胞们疯狂 “续粮”。

每天，咱都得化身 “手动调节大师”，对着滤液泵和废弃泵一顿操作猛如虎，就为了让两种条件下的细胞密度稳定在约 20 x 10^6 cells/mL ，这密度，细胞们估计都得挤着喊 “别贴贴，贴贴危险又密不透风”！同时，还得按比例调节泵，保证整个稳态灌流过程都能维持 1 VVD，这就像是给细胞们安排了专属的 “流量套餐”，不多不少，刚刚好。

最后，咱们把实验结果和第 13 天的数据掰扯掰扯做对比。不过对照组的反应器属于 “超长待机王”，一口气运行了 20 天，堪称培养界的 “马拉松选手”！

图4. 灌流培养工艺条件及指标。活细胞密度（A）、活力（B）、葡萄糖含量（C）、半乳糖含量（D）、氨含量（E）和乳酸含量（F）。

在工艺条件这场 “培养物生存大挑战” 里，两种条件下的培养物堪称 “活力担当”！瞅瞅图 4B 就知道，它们在大部分 “运行时光” 里，活力值都稳如泰山，牢牢守住 90% 以上的 “生命线”，主打一个生命力顽强。

再把目光转向葡萄糖水平，两种条件下的培养物仿佛约好了似的，默契地把葡萄糖含量控制在 0.5 到 1g/L 这个 “舒适圈” 里（见图 4C），就像精准的 “葡萄糖管理大师”。添加了 + Gal/Mn 的培养物在半乳糖这块也有 “独家操作”，从图 4D 能看到，半乳糖水平稳定在 1 到 1.5g/L。这数据背后藏着个 “小秘密”—— 在细胞密度达到巅峰后的稳态灌流阶段，每天大概有 0.3–0.8g/L 的半乳糖被 “悄悄消耗”，也不知道这些培养物是拿半乳糖当 “能量饮料”，还是搞什么 “神秘仪式”。

说到和对照组的 “battle”，添加 + Gal/Mn 的培养物在氨水平上直接 “碾压”，比对照组低了约 0.5g/L（图 4E），妥妥的 “氨含量卷王”。不过在乳酸水平上，它又画风一转，平均比对照组高（图 4F），上演了一出 “高低起伏” 的戏码。

当我们对比不同培养条件下的胞外氨基酸谱，好家伙，大部分氨基酸都跟 “复制粘贴” 似的，走势相当一致。但 + Gal/Mn 培养物的天冬氨酸却 “不走寻常路”，含量那叫一个高！这高含量天冬氨酸可不是 “花瓶”，它和更高的细胞生产力 “锁死” 了，不过和细胞生长倒是没啥 “亲密关系”。这一系列结果，简直就是 mAb 生产力提高的 “实力认证”！

灌流培养滴度和糖基化

平均而言，添加+Gal/Mn的生物反应器比对照组产物产量更高（图 5A）。每种条件下都存在一些扰动，这可以通过手动更改废弃泵和滤液泵来解释，这些更改会影响细胞密度。然而，即使存在这些扰动，添加+Gal/Mn的反应器的产量仍然比对照组更高。在补料分批实验中，已知使用半乳糖代替葡萄糖会导致生产收益递减，因为半乳糖的转运速度低于葡萄糖。Gramer等人的一项研究表明，使用半乳糖代替葡萄糖会导致生产收益递减。研究了尿苷、锰和半乳糖在补料分批培养中的使用情况，发现少量添加这些补料添加物（即 0.9 g/L 半乳糖、2 μM MnCl 2和 1 mM 尿苷）会对产量产生积极影响，但随着半乳糖、锰和尿苷浓度的增加，产量会略有下降。这可能也适用于灌流，这可能有助于了解为什么生产率高于对照培养。据我们所知，没有文献涉及添加半乳糖作为补料添加物来提高生产率。然而，已知用半乳糖部分替代葡萄糖会对生产率和最终产量产生不利影响。

图5. 灌流培养的滴度、糖指数和糖前体。图中显示了每日反应器滴度 (A)、相对半乳糖基化指数 (B) 和甘露糖基化指数 (C)。图中还显示了核苷酸糖聚糖前体 UDP-半乳糖 (D) 和 UDP-葡萄糖 (E) 的细胞特异性浓度。

在图 5B 里，GI 就像个 “低调的主角”，默默展示着自己的存在。咱们先瞧瞧对照培养物，它的半乳糖基化率简直和 24 小时对照补料分批培养物是 “孪生兄弟”，相似度极高！到了第 10 天，对照培养物的相对半乳糖基化率 “慢悠悠”地爬到了 25% 左右，就像个不紧不慢散步的 “小蜗牛”。

再把目光转向 + Gal/Mn 添加培养物，它可就 “干劲十足” 了！在培养期间，半乳糖基化率一路 “高歌猛进”，直接冲到了 54% - 56%，这成绩和之前 24 小时添加补料分批培养实验里的表现几乎 “一模一样”，妥妥的 “优秀生”！

接下来研究 UDP - Glc 水平（图 5E），补料分批培养物这边，对照培养物的 UDP - Glc 水平在培养结束时，就像泄了气的皮球 —— 直线下降。灌流培养那边呢，也有类似趋势，不过对照灌流运行可聪明着呢！因为葡萄糖不断 “送货上门”，流入培养基，所以它的 UDP - Glc 池永远不会 “弹尽粮绝”。+Gal/Mn灌流培养的细胞内 UDP - Glc 水平更是 “稳如泰山”，始终保持恒定。说起来可有意思了，第 10 天之后，对照组的 UDP - Glc 水平 “一路滑坡”，而 + Gal/Mn 灌流培养的 UDP - Glc 水平却牢牢 “守住阵地”，稳稳保持在 0.4 至 0.6 fmol/cell 之间，估计是 UDP - Gal 在偷偷 “搞事情”，转化成 UDP - Glc 了！

再来对比灌流培养之间的 UDP - Gal 水平（图 5D），只要在补料里加点半乳糖和锰，UDP - Gal 水平就像被按了 “上升键”，蹭蹭往上涨，这效果太显著了！+Gal/Mn 里这么高的 UDP - Gal 水平，也难怪半乳糖基化率会 “一路飙升”。不过有趣的是，半乳糖基化的最高水平好像就到 55%，和葡萄糖缺乏的补料分批隔日补料下 70% 的更高累积率相比，还是差了点。之前也提到过，灌流反应器采用连续补料的方式，半乳糖基化率反而比每日或隔日补料的要低，这就像一道神秘的 “谜题”。看来得安排更多研究，好好 “审问” 一下葡萄糖饥饿对半乳糖基化的影响，说不定能找到让半乳糖基化率 “疯狂上涨” 的 “隐藏秘籍”呢！

最后看看 MI（图 5C），甘露糖基化在对照培养物里 “躺平”，稳定在 2% 左右，在 + Gal/Mn 培养物里也差不多，稳定在 1.5% 左右。这结果和咱们在补料分批每日补料对照培养物、添加 Gal/Mn 的培养物里得到的几乎 “如出一辙”，细胞们在这方面还挺 “念旧”，保持着一贯的 “风格”！

结论

此次研究聚焦于 CHO 细胞培养进程中，单克隆抗体糖基化模式随时间的动态变化，同时通过观察添加半乳糖和锰后关键代谢物的变动，深入剖析其内在机制。研究采用两种实验模式：其一为补料分批生物工艺，按比例添加半乳糖与葡萄糖，并于首日添加锰（添加频率分为每日添加或隔日添加），以此探究葡萄糖限制这一次要变量的作用；其二为灌流操作（无营养限制），将半乳糖和锰加入培养基，保持培养物处于稳定状态。

在补料分批培养研究中，结果显示，对峰值细胞密度影响显著且积极的因素是补料时间表，而非半乳糖的添加。与其他补料策略相比，每日补料方案使峰值乳酸产量提升了 0.7 g/L。不过，隔日补料在培养后期会产生更高的氨产量，原因在于每日补料培养物能更有效地将氨代谢为丙氨酸。半乳糖补料和补料时间对葡萄糖消耗率影响较小，这或许与乳酸的共同消耗有关。研究证实，半乳糖消耗率会随胞外半乳糖浓度升高而增加，这与既往研究结论相符。虽然半乳糖和补料方案对峰值滴度无影响，但隔日补料培养物在前半段培养期的平均产量更高。除培养性能存在差异外，补料方案对 mAb 糖基化的影响最为突出。添加半乳糖和锰显著提升了半乳糖基化速率，其中隔日补料培养物的半乳糖基化率高达 70%，而每日补料培养物仅为 50%。与对照组相比，添加半乳糖和锰后，所有实验组的甘露糖基化率均有所下降。

灌流研究表明，添加半乳糖和锰能够提高对照培养物的滴度，半乳糖基化水平也显著提升。添加半乳糖和锰的培养物，其相对半乳糖基化水平达到 55%，而对照培养物则降至约 25%。添加半乳糖可恢复 UDP - 葡萄糖池，而对照培养物中的 UDP - 葡萄糖在培养过程中会逐渐耗尽。该研究进一步揭示了糖基化网络以及聚糖前体对 CHO 细胞代谢及其 N - 糖基化途径的影响。

综上，本研究初步明确了半乳糖和锰对 mAb 产品质量的影响机制。后续研究将着重深化相关理解，并运用过程分析技术（PAT），构建基于精准糖基前体剂量的工艺控制方案，推动上游生物工艺实现均质糖基化。

原文：A. Gyorgypal, E. Fratz-Berilla, C. Kohnhorst, et al., Temporal Galactose-Manganese Feeding in Fed-Batch and Perfusion Bioreactors Modulates UDP-Galactose Pools for Enhanced mAb Glycosylation Homogeneity. Biotechnology and Bioengineering, 2025.

识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！

请注明：姓名+研究方向！

本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。