人类细胞培养基的革新：从挑战、创新到未来展望

摘要：在再生医学、细胞治疗和个性化医疗的发展进程中，优化的细胞培养基至关重要。传统培养基如 Eagle's MEM 和 DMEM 虽推动了基础研究，但主要为非人类细胞设计，无法满足人类细胞独特的代谢和功能需求。本文回顾了细胞培养基的发展历程，剖析了在可重复性、可扩展性及伦理方面的持续挑战，尤其是对动物来源成分（如胎牛血清）的依赖问题。文中重点介绍了无血清和化学成分确定培养基的创新成果，这些成果通过提高一致性、符合良好生产规范及解决伦理问题，为细胞培养提供了有前景的替代方案。同时，探讨了基于组学的分析、高通量筛选和人工智能驱动的培养基设计等新兴方法，这些方法正通过精准适配特定人类细胞类型和患者来源细胞的需求，重塑培养基优化模式。此外，还讨论了经济和监管方面的挑战，强调需要经济高效且可扩展的解决方案以促进临床转化。展望未来，整合 3D 生物打印、器官芯片系统和个性化培养基配方等先进生物技术，为人类细胞培养带来了变革性机遇，这些创新符合伦理和临床标准，能推动人类特异性培养基系统的发展，确保可重复性、可扩展性并增强治疗潜力，从而推动研究和临床应用的进步。一、引言：细胞培养基的发展与挑战1.1 传统培养基的里程碑与局限

Eagle's Minimum Essential Medium（MEM）和 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）的问世是细胞生物学和组织培养领域的重要里程碑，为体外培养人类和动物细胞提供了基础，极大地推动了生物医学研究。然而，这些培养基的设计主要基于啮齿类动物的代谢特征，与人类细胞存在生理不匹配。例如，人类血浆中不存在尿酸，但经典培养基中普遍含有尿酸，这会抑制人类细胞中的核苷酸生物合成。这种不匹配在 CAR-T 细胞等治疗应用中尤为明显，次优的培养基会导致 T 细胞耗竭和功能变异。

1.2 向人类特异性培养基的转变

20 世纪 70 年代推出的 L-15 培养基是向人类特异性细胞培养转变的关键一步，它专门为原代人类成纤维细胞设计。20 世纪 80 年代，Iscove's IMDM 取得了重要进展，它用转铁蛋白/白蛋白替代血清，适用于造血细胞。然而，这些突破在当时仍属小众，大多数领域仍依赖 DMEM/RPMI 配方，而这些配方并不适合人类细胞较低的抗氧化能力和独特的营养吸收模式。长期以来，人类细胞特异性培养基的研究未得到充分探索，许多研究人员依赖动物来源配方的改编，未能充分考虑物种间的显著代谢差异。

1.3 无血清和化学成分确定培养基的兴起

无血清和化学成分确定培养基（CDM）的创新为人类细胞培养提供了更合适的解决方案，它们通过去除动物来源成分，提高了一致性、可扩展性并解决了伦理问题。例如，设计用于维持干细胞多能性和功能的无血清培养基在减少变异性的同时，降低了与动物来源产品相关的污染风险。尽管无血清培养基降低了批次间的变异性，但其成本仍然过高。例如，人类血小板裂解液（HPL）可增强间充质干细胞（MSC）的扩增，但会引入依赖供体的细胞因子，从而影响免疫调节谱，这一权衡在转化研究中常被忽视。

二、人类细胞培养基的优化：现状与挑战2.1 人类细胞的代谢和功能多样性

人类细胞表现出不同的代谢和功能需求，这需要定制化的培养基配方，而通用培养基的开发受到人类细胞类型独特需求的阻碍。例如，干细胞（包括诱导多能干细胞（iPSCs）和胚胎干细胞（ESCs））依赖基本成纤维细胞生长因子（bFGF）和转化生长因子 -β（TGF-β）等生长因子来维持多能性和自我更新。这些细胞的培养基配方必须确保营养和信号分子的正确平衡，以防止分化并促进细胞增殖。表 1总结了市售培养基的关键信息，强调了它们在支持特定人类细胞类型方面的优缺点。干细胞培养基如 mTeSR™1 和 Essential 8™是无动物成分配方的典范，它们用胰岛素和白蛋白等确定成分替代血清，在解决伦理问题的同时维持多能性。

免疫细胞如 T 细胞和自然杀伤（NK）细胞需要细胞因子（如 IL-2、IL-15）来维持活化和增殖，这与干细胞的生长因子需求形成鲜明对比。这种多样性延伸到治疗应用中，次优的培养基会影响 CAR-T 细胞的疗效或干细胞的分化。例如，补充 HPL 的无血清培养基可增强 NK 细胞的扩增并保持其功能。间充质干细胞（MSCs）进一步说明了这种多样性，在无血清条件下，自体血浆可提高 MSC 的生长速率，而活化 T 细胞的代谢从氧化磷酸化转向糖酵解，这凸显了对富含葡萄糖配方的需求。这些例子强调了针对特定细胞类型优化培养基的必要性，以满足其独特的营养利用模式。

2.2 市售培养基的成分分析

由于有数百种可用的培养基成分和各细胞系的独特要求，市售培养基的成分差异很大。对市售培养基的比较评估了培养基之间的变异性和对特定细胞培养的适用性。我们回顾了 48 种常用于人类细胞培养的商业培养基和补充剂，其中只有 25 种提供了详细的成分信息（表 2）。在这些已知成分的培养基中，13 种是基础培养基（需要补充血清或其他添加剂以实现最佳细胞生长的配方），1 种是低血清培养基（需要减少血清补充的基础培养基），8 种是无血清培养基（不需要血清补充的完整培养基），3 种是血清替代补充剂（旨在模拟血清的配方）。尽管人类细胞系可能有不同的营养需求，但 9 种基础培养基对应经典培养基配方，这些配方也更广泛地用于哺乳动物和昆虫细胞培养。因此，像 DMEM 和 RPMI-1640 这样的经典培养基未能满足人类细胞的细致需求。

对 25 种商业培养基的分析表明，基础配方缺乏关键的人类特异性成分。例如，IMDM 和 Neurobasal Medium 包含 HEPES 用于 pH 缓冲，但省略了硒等微量元素，而硒对干细胞的存活至关重要。在成分比较中，总共鉴定出 159 种成分，其中超过 50% 的成分被鉴定为微量元素、氨基酸和无机盐（图 1），成分根据培养基配方提供的类别进行分类。最常见的成分包括氨基酸（包括所有必需氨基酸）、葡萄糖、维生素（B 族、胆碱和生物素）和无机盐（钙、钾、镁和钠）。占成分 24.5% 的 “其他” 类别作为不常出现的成分或分组的统称，例如，它包括非营养成分如酚红（一种常见的 pH 指示剂）和 HEPES（一种缓冲剂）以及胸苷等核苷。

2.3 血清依赖的局限性与伦理挑战

胎牛血清（FBS）由于其富含生长因子和营养物质，仍然是细胞培养的基石。然而，FBS 的批次间变异性和污染风险破坏了实验的可重复性和临床安全性。FBS 的不确定性进一步加剧了这些问题，它含有未知的细胞因子、生长因子和性激素，会不一致地影响细胞行为。

FBS 中存在的性激素，如雌激素和睾酮，会在细胞反应中引入性别特异性偏差。例如，含血清培养基中生理水平的雌激素会改变工程肾脏模型中肾小管细胞的代谢和药物反应，凸显了性激素对体外系统的未被充分认识的影响。这种变异性使数据解释复杂化，并降低了转化相关性，尤其是在个性化医疗应用中。

HPL 和 CDM 已成为替代方案，提供了更好的一致性并减少了伦理问题。CDM 具有完全表征的成分，消除了动物来源的污染物和性激素，符合 GMP 用于临床应用。然而，CDM 的开发面临着在复制血清的生长促进复杂性的同时保持成本效益的挑战。

2.4 监管与经济挑战

新的人类细胞培养基的开发受到严格的监管审查，特别是来自美国食品和药物管理局（FDA）等机构。例如，2021 年，FDA 发布了行业指南《人类基因治疗研究性新药申请的化学、制造和控制（CMC）信息》，该指南强调了所有成分的详细表征的必要性，包括细胞培养基（FDA Q8 (R2)）。全球范围内，欧洲药品管理局（EMA）和日本药品和医疗器械管理局（PMDA）等监管机构与 FDA 标准保持一致。人用药品技术要求国际协调会议（ICH）Q5D（用于生产生物技术/生物制品的细胞基质的衍生和表征）等协调指南的使用，凸显了全球对培养基成分的审查，这主要集中在确保这些培养基配方的安全性和有效性，特别是用于基于细胞的治疗等临床应用。每种新的培养基配方必须经过全面的验证过程，包括一致性、无菌性和维持细胞健康和行为的功能评估等严格测试。

转向符合 GMP 的人类细胞培养基通过严格的制造标准和严格的质量控制措施（如无菌和支原体检测）显著提高了可重复性。这些培养基消除了血清基配方中不确定成分的可变性，从而提高了实验和临床结果的可靠性。例如，与非 GMP 替代品相比，符合 GMP 的无动物成分培养基已被证明能维持 MSC 的分化潜力和免疫表型，同时支持更高的增殖率。然而，由于需要原材料可追溯性、广泛的验证以及遵守 ISO 13485 和 FDA 21 CFR Part 820 等监管框架，符合 GMP 的培养基成本高出 2-5 倍。尽管有这些前期费用，但长期利益包括减少批次失败、简化监管批准以及改善治疗制造的可扩展性。研究表明，GMP 培养基的可靠性和一致性通过最大限度地降低污染风险和确保符合临床标准，抵消了其较高的成本，使其成为基于细胞的治疗和再生医学的必不可少的。

三、培养基优化的创新方法3.1 水解物作为复杂培养基成分

水解物是通过蛋白质的酶消化获得的，作为人类细胞培养基补充剂的潜力在于它们能够提供肽、氨基酸和代谢物的复杂混合物。最近的研究，包括基于 NMR 的代谢组学分析，已经开始系统地表征水解物的代谢物组成，揭示了变异性，但也为在人类细胞培养系统中定制其使用提供了重要机会。例如，酵母来源的水解物含有高浓度的必需氨基酸和核苷，这对支持体外人类细胞的代谢需求至关重要。这些见解强调了水解物在减轻批次间变异性的同时，为完全确定的培养基提供经济有效的替代方案的潜力。

虽然关于水解物的基础研究主要集中在动物细胞系统，但这些发现为其适应人类特异性应用提供了基础。例如，亚麻籽蛋白水解物已被证明能提高 CHO 细胞培养中的活细胞密度和重组蛋白滴度，而大豆蛋白水解物则改善了哺乳动物系统中的 IgG 生产。然而，将这些益处转化为人类细胞需要优化以适应物种特异性代谢途径和功能需求。水解物的促生长特性归因于它们的肽谱，这可能满足不同人类细胞类型的营养需求，尽管这需要严格的验证。

例如，源自牛骨胶原水解物的肽已被证明与表皮生长因子受体（EGFR）相互作用，促进成骨细胞增殖并调节细胞周期进程。类似地，在植物蛋白基饮食中补充水解物已被发现能增强斑节对虾等水生物种的生长性能，强调了水解物混合物影响生长因子类似物的潜力。此外，对 CHO 细胞培养的研究已经证明了肽水解物的生物活性，突出了它们改善细胞生长和生产力的能力。除了促进生长外，水解物还表现出抗应激作用，这是人类细胞培养中的一个关键挑战。研究表明，燕麦麸蛋白水解物和鱼蛋白水解物分别减轻了肝细胞和上皮细胞系中的氧化损伤，表明它们与人类特异性应用的相关性。这种抗氧化活性在培养诱导的应激下保护细胞活力和功能特别有价值，使水解物成为多功能添加剂。

3.2 高通量筛选与自动化

高通量筛选（HTS）在细胞培养基优化中的主要优势之一是其能够同时筛选大量培养基成分库。例如，集成机器人系统用于高通量工艺开发的实用性，可应用于筛选细胞培养基成分并评估其毒性。这种方法允许识别增强细胞生产力同时最大限度减少血清使用的补充剂，这对降低成本和提高细胞培养的可重复性至关重要。此外，HTS 系统的模块化便于细胞类型和培养基成分的平行筛选。一种可容纳 3D 人类神经祖细胞培养的微阵列芯片平台，展示了针对特定细胞类型的培养基配方进行高通量筛选的潜力。这种能力对于开发支持复杂细胞行为和相互作用的培养基至关重要，尤其是在更好地模拟体内环境的 3D 培养中。

微流体技术的集成进一步提高了培养基优化的效率。例如，使用微工程类器官芯片系统，允许控制培养条件和精确操作培养基成分，使研究人员能够更准确地预测细胞反应。这些平台可用于系统地改变培养基成分并评估其对细胞活力和功能的影响，从而简化优化过程。除了识别最佳培养基配方外，HTS 技术在理解培养基成分和细胞反应之间的相互作用方面也发挥着关键作用。高通量筛选技术的原理可用于评估各种培养基对细胞行为的影响，这可能导致发现增强细胞性能的新型培养条件。这种方法允许同时评估多个参数，如细胞形态、增殖率和代谢活性，提供关于培养基成分如何影响细胞结果的全面理解。

3.3 组学技术的整合

组学驱动框架的整合通过实现针对特定细胞需求的精确、数据驱动的培养基配方优化，显著改变了人类细胞培养基的开发。转录组学通过识别不同培养基条件下的基因表达变化发挥了关键作用，从而指导营养成分的调整以支持最佳细胞功能。例如，转录组学和合成生物学方法发现，胰岛素样生长因子结合蛋白 - 4（IGFBP-4）和水通道蛋白 1（AQP1）等基因的功能性缺失对细胞适应无血清悬浮培养至关重要。这些发现促进了支持 CHO 细胞用于生物制药生产的培养基的设计。表观遗传学研究进一步强调了在敏感细胞类型（如人类胚胎和多能干细胞）中维持基因组完整性的重要性。培养基配方必须最大限度地减少 DNA 甲基化变化和组蛋白修饰，这对长期培养中保持细胞功能和稳定性至关重要。此外，表观遗传建模已成为维持细胞身份和驱动细胞转化的强大工具，像 EpiMOGRIFY 这样的平台利用表观基因组数据来预测可扩展细胞治疗制造的最佳培养条件。这些发现强调了对化学成分确定的无血清培养基的需求，以确保再生医学和生物制造中的可重复性。

代谢组学分析提供了细胞培养系统中营养利用和代谢瓶颈的详细理解。例如，基因组规模的代谢模型整合转录组学和通量数据来预测营养需求，从而能够针对性地补充天冬酰胺和谷氨酸等氨基酸，以增强细胞活力和生产力。代谢组学还识别出损害细胞生长的培养基降解产物。例如，核黄素和色氨酸的降解会产生活性氧并消耗关键营养物质，导致氧化应激和增殖减少。通过监测这些变化，研究人员可以调整配方以稳定关键代谢物并延长培养基效力。

3.4 人工智能驱动的培养基设计

优化细胞培养基仍然是一项关键但具有挑战性的任务，因为成分的高维度及其非线性相互作用。传统的经验方法和标准实验设计（DoE）往往无法捕捉这些复杂的关系，促使转向数据驱动的算法优化策略。例如，使用带有梯度提升决策树的主动学习可以高效地迭代优化广泛使用的基础培养基，尽管存在噪声和有限的数据，但仍能精确定位关键成分相互作用。

机器学习已被用于直接优化培养基配方（图 4）。例如，一种用于按需无血清配方的高维搜索算法，同时将主动学习应用于专门为 HeLa 细胞定制培养基。此外，另一项研究表明，通过主动学习迭代微调多种培养基成分可显著提高细胞性能。

基于这些见解，人类细胞最佳培养基配方的设计越来越依赖于计算建模和人工智能，以预测和优化营养组合。通过将高通量实验数据与计算建模无缝集成，支持向量机（SVM）、k 最近邻（kNN）、随机森林和神经网络等一系列机器学习模型在主动学习框架内处理这些数据（图 4）。通过 AUC、真阳性和假阳性率等性能指标证明的迭代训练和验证，能够提取关键特征的差异表达和丰度数据分析。这些输入随后由机器学习模型（包括 SVM、kNN、随机森林和神经网络）处理。这种方法最大限度地减少了实验室试错，从而支持开发可重复和可扩展的培养基配方，以增强细胞性能。

四、未来展望：个性化与可持续的培养基发展

未来细胞培养基优化的发展将通过个性化培养基配方、可持续生产实践以及 3D 生物打印和器官芯片技术等先进生物技术应用的整合而显著发展。这项技术已成功应用于各种场景，包括血管化组织和肿瘤微环境的工程，这对研究药物反应和疾病机制至关重要。此外，器官芯片系统可以利用个性化培养基创建模拟器官功能的动态模型，允许实时监测细胞对治疗剂的反应。这些技术的结合不仅提高了体外研究的相关性，还可以加速精准医学从实验室到临床的转化。生物打印肿瘤模型优化 CAR-T 细胞疗法的潜力，凸显了患者特异性环境在治疗成功中的重要性。此外，3D 生物打印模型的开发允许纳入各种细胞类型和细胞外基质成分，可以微调以更紧密地模拟体内条件。使用生物相容性材料和环保生产技术可以显著降低培养基制造的碳足迹。正如 Ali 的工作所强调的，无动物成分的生物打印模型的开发不仅增强了生物相容性，还与生物医学应用中的可持续发展目标保持一致。

总之，细胞培养基优化的未来在于个性化、可持续性和技术整合的交叉点。尽管个性化培养基配方在精准医学中前景广阔，但解决成本、复杂性和监管批准等挑战对于其广泛采用至关重要。同时，培养基生产的可持续性和先进生物技术方法的整合将在塑造生物医学研究和治疗发展的未来格局中发挥关键作用。

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