孕妇缺铁竟能改变胎儿性别？大阪大学团队揭示铁依赖表观遗传机制

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亚铁离子（Fe²⁺）在所有真核细胞中对于多种氧化还原反应都是必不可少的，包括DNA和蛋白质的去甲基化反应。组蛋白的去甲基化作用对于雄性性别决定过程中发育中的性腺中Y染色体上的性别决定基因Sry的正常表观遗传调控是必需的。

基于此，2025年6月4日，大阪大学Makoto Tachibana研究团队在Nature杂志发表了“Maternal iron deficiency causes male-tofemale sex reversal in mouse embryos”揭示了母体缺铁导致小鼠胚胎的雄性向雌性性别逆转。

在本研究中，作者探讨了铁代谢、组蛋白去甲基化与哺乳动物性别决定之间的潜在联系。发现在小鼠胚胎性腺性别决定期，产生Fe²⁺的相关代谢通路显著激活。在培养的XY性腺中，螯合铁元素降低了KDM3A介导的Sry基因H3K9位点的组蛋白去甲基化水平，几乎完全抑制了Sry的表达并导致性腺开始表达卵巢标志物。在体内实验中，对胎儿XY性腺体细胞中Tfrc基因进行条件性敲除（该基因对于铁的摄取至关重要）或在怀孕小鼠中使用药物急性抑制可利用的铁含量，均导致部分后代发生由雄性向雌性的性腺性别逆转，突显了铁代谢在雄性性别决定中的关键作用。最后，长期给予怀孕小鼠低铁饮食同时结合一个本身无明显表型的Kdm3a杂合变异体，会抑制Sry的表达并导致部分子代发生雄性向雌性的性别逆转，揭示了母体膳食铁摄入与胎儿发育结果之间的联系。

图一 铁代谢通路在雄性性别决定期间在胚胎性腺中被特异性激活

参与细胞铁代谢的基因和蛋白质可以根据其功能分为三类：铁的摄取、Fe²⁺的生成，以及铁的排出。作者首先研究了这些基因在小鼠性腺发育过程中的活性。从性别决定期（E11.5）的性腺和中肾中分离出NR5A1+的性腺体细胞和NR5A1−的中肾及生殖细胞：只有前一群细胞参与性别决定。定量mRNA表达分析证实，NR5A1+细胞中含有Sry表达的细胞，而NR5A1−细胞中没有。与之前的研究一致，Kdm3a在NR5A1+细胞中的表达比在NR5A1−细胞中更丰富。铁摄取基因Tfrc和Scara5以及Fe²⁺生成基因Slc11a2、Steap3、Ncoa4和Hmox1，在NR5A1+细胞中的表达也高于NR5A1−细胞，而铁排出基因Slc40a1和Heph的表达趋势则相反。总体来看，在负责性腺性别决定的细胞中，Fe²⁺在细胞质和细胞核中有所积累。此前有研究使用单细胞RNA测序技术分析了小鼠性腺性别决定过程中不同细胞类型的基因表达情况。分析了该数据集，以研究E11.5时期性腺和中肾中各个细胞类型中铁代谢相关基因的表达谱。铁摄取和Fe²⁺生成基因以及Kdm3a在前塞尔托利细胞中的表达比其他性腺细胞类型更高。作者还分析了人类XY发育性腺的单细胞RNA测序数据，结果显示在性别决定期，负责雄性性别决定的细胞中KDM3A以及铁摄取和Fe²⁺生成基因的表达水平显著高于其他细胞类型。接下来，通过免疫荧光检测了完整E11.5XY性腺中铁代谢蛋白的表达。NR5A1和GATA4蛋白被用作性腺体细胞的标记。铁摄取蛋白TFR1和SCARA5，以及Fe²⁺生成蛋白NCOA4和HO1在性腺中的表达强于其他组织（肝脏除外，它是主要的铁储存器官）。KDM3A也在性腺中高表达，还通过免疫印迹分析了这些蛋白在不同组织中的分布。铁摄取和Fe²⁺生成蛋白在E11.5XY胚胎的NR5A1+性腺细胞、胎盘和肝脏中均有丰富表达。为了检测细胞内游离Fe²⁺的含量，使用了荧光探针FeRhoNox-1。E11.5性腺中Fe²⁺对应的荧光信号强度较高。综上所述，在负责性别决定的性腺细胞中存在有利于Fe²⁺积累的基因和蛋白表达特征。相应地，电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析显示，NR5A1+细胞中的总铁含量（包括非血红素和血红素铁）是NR5A1−细胞的1.8倍。

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图二 TFR1介导的铁摄取增强了Sry基因的H3K9去甲基化

为了评估铁代谢对Sry表观遗传调控的潜在作用，作者建立了缺乏铁代谢基因的小鼠模型。重点关注Tfrc（TFR1）基因，该基因在细胞铁摄取过程中起核心作用，通过内化转铁蛋白-铁复合物实现铁的摄入。由于Tfrc的全身敲除会导致在性别决定前胚胎死亡，因此采用了一种策略，在性别决定前特异性地破坏性腺体细胞中的Tfrc。在Tfrc的第3外显子两侧插入了loxP序列，以构建条件性突变等位基因（Tfrc2l）。随后将这些小鼠与Wt1creERT2小鼠交配，后者可通过注射4-羟基他莫昔芬（4-OHT）诱导Cre重组酶进入早期性腺体细胞核。在E8.5时向携带Wt1creERT2;Tfrc1l/2l基因型的母鼠注射4-OHT，并在E10.8确认TFR1在胚胎性腺体细胞中被特异性敲除。将接受4-OHT处理的Wt1creERT2;Tfrc1l/2l胚胎及小鼠命名为Tfrc1l/2l条件性敲除（Tfrc1l/2l-cKO）。在E10.8时，XY对照组性腺中游离Fe²⁺水平维持较高，而在Tfrc1l/2l-cKO XY性腺中显著下降，表明TFR1缺失阻碍了性别决定前Fe²⁺的生成。作者发现E11.5时，Tfrc1l/2l-cKO XY性腺中NR5A1+性腺体细胞数量与对照组相当，说明TFR1缺失可能不影响这类细胞的增殖能力。但Tfrc1l/2l-cKO NR5A1+细胞总铁含量降至对照组的一半，储存铁的H-铁蛋白也减少至约三分之一。E11.5时，Tfrc1l/2l-cKO XY性腺中H3K9me2水平显著升高，定量分析显示其水平约为对照组的两倍，提示TFR1缺失影响了性腺体细胞中的H3K9去甲基化过程。mRNA表达分析显示，Tfrc1l/2l-cKO NR5A1+细胞中Sry表达量降至对照组的一半。另一Fe²⁺生成途径相关基因Hmox1表达上调，提示可能存在代偿机制。免疫荧光分析显示，Tfrc1l/2l-cKO XY性腺中SRY平均表达量仅为对照组的约50%。为研究TFR1缺失是否影响Sry启动子区域的H3K9me2修饰，作者对分离的NR5A1+细胞进行了ChIP–qPCR分析，结果显示Tfrc1l/2l-cKO中Sry启动子区域的H3K9me2水平比对照组高近一倍，提示Sry位点的H3K9去甲基化受阻。进一步观察了青少年或成年阶段的Tfrc1l/2l-cKO小鼠的内外生殖器，在39只XY Tfrc1l/2l-cKO小鼠中，有6只出现由雄性向雌性的性反转，具有两个卵巢，另有一只部分雌性化，具有一侧卵巢和一侧睾丸。相比之下，所有XX Tfrc1l/2l-cKO小鼠均发育为正常雌性。XY Tfrc1l/2l-cKO小鼠的性反转表型与Kdm3a缺失小鼠相似。综上所述，胚胎性腺体细胞中铁稳态的正确维持对于正常的雄性性别决定至关重要，并揭示了TFR1介导的铁摄入通路在KDM3A调控的Sry表观遗传机制中的作用。

图三 药物诱导的母体铁缺乏可导致发育中的胚胎在子宫内发生由雄性向雌性的性反转

作者进一步测试了母体铁缺乏是否会影响胚胎在子宫内的性别发育。首先，在胚胎性别决定时期，通过药物诱导母体铁缺乏：从E6.5至E10.5每天向怀孕母鼠口服铁螯合剂DFX随后检测胚胎在子宫内的性别发育情况。由DFX处理的母鼠所生E11.5胚胎表现出典型的贫血症状，其身体颜色苍白，并且NR5A1+细胞中H-和L-铁蛋白水平显著降低。在DFX处理母鼠所生的72只XY小鼠中，有4只具有两个卵巢，1只具有一侧卵巢和一侧睾丸，这表明在性别决定期发生的急性母体铁缺乏会导致部分野生型后代出现由雄性向雌性的性反转。由于DFX处理组与对照组母鼠所怀E11.5 XY胚胎性腺中NR5A1+细胞数量无明显差异，说明DFX并未影响胚胎性腺体细胞的增殖能力。另一方面，在DFX处理母鼠所怀XY胚胎的性腺中，SRY表达显著下降，仅为对照组XY性腺中的约60%。NR5A1+细胞中Sry mRNA表达也显著减少，约为对照组的40%。在DFX处理母鼠所怀胚胎的NR5A1+细胞中，铁缺乏导致Kdm3a和铁代谢相关基因的上调以及KDM3A靶基因的下调。这些数据表明，母体铁缺乏至少部分通过抑制KDM3A活性，从而内在地影响了发育中胚胎Sry（及SRY）的激活。还研究了母鼠接受DFX处理后对胚胎性腺性别分化的影响，发现E13.5时，DFX处理母鼠所怀XY胚胎的性腺表现为典型的卵睾组织，其中同时存在FOXL2+细胞和SOX9+细胞，FOXL2+细胞比例达到约20%。通过强制表达Hsp-Sry转基因来恢复SRY功能，可有效将DFX处理母鼠所怀XY胚胎性腺中FOXL2+细胞的比例降低至接近对照组XY性腺的水平，表明DFX处理母鼠所怀XY胚胎性腺出现卵睾表型是由于Sry（SRY）表达减少所致。

图四 饮食诱导的母体铁缺乏会损害发育中胚胎在子宫内的雄性性别决定通路

最后，为了评估母体饮食中铁摄入量的减少是否会影响胚胎的性别发育，作者在雌性小鼠怀孕前四周至怀孕期间共六周的时间内，给予其铁缺乏饮食（IDD）。在母鼠中，IDD处理逐步降低了血红蛋白水平和红细胞数量，在胚胎发育至性别决定阶段（E11.5）时观察到了贫血现象。将IDD喂养母鼠所怀胚胎的性腺称为IDD性腺，将对照饮食（CD）喂养母鼠所怀胚胎的性腺称为CD性腺。在E11.5时，IDD性腺中NR5A1+细胞的细胞内铁含量约为CD性腺中的60%。通过蛋白质表达分析确认了胎儿铁缺乏状态：与CD性腺相比，IDD性腺中TFR1表达升高，而H-和L-铁蛋白表达降低。同样，IDD性腺与CD性腺之间的NR5A1+细胞数量没有明显差异。作者发现由IDD喂养母鼠所生的野生型XY后代在出生后发育正常。已知性别决定通路具有剂量敏感性和稳态特性，因此某些干扰并不容易表现为性反转。因此，在研究性别决定通路扰动的表型效应时，常用一种敏感化的遗传背景进行检测。因此使用携带Kdm3a杂合突变（Kdm3aΔ/+）的胚胎重复实验，这些胚胎表型正常，但对H3K9去甲基化受损更为敏感。在IDD喂养母鼠所生的43只XY后代中，有2只出现了由雄性向雌性的性反转，而在CD喂养母鼠所生的60只后代中均未出现这一表型。对E13.5胚胎性腺性别分化的检测显示，在Kdm3a+/+ IDD性腺中出现了FOXL2+细胞，而在Kdm3aΔ/+ IDD性腺中这类细胞的数量更多。这些数据表明，母体饮食引起的铁缺乏可以作为一种诱导因素，导致具有特定遗传背景的哺乳动物胎儿发生由雄性向雌性的性反转。在XY Kdm3a+/+ IDD性腺中，SRY表达下降至Kdm3a+/+ CD性腺中的约70%；而在E11.5 XY Kdm3aΔ/+性腺中，SRY表达进一步下降至Kdm3a+/+ CD性腺中的约50%。在不同基因型和饮食条件下发育的XY性腺中，H3K9me2水平最高出现在Kdm3aΔ/+ IDD性腺中，其次为Kdm3a+/+ IDD性腺，最低为Kdm3a+/+ CD性腺。这些数据支持母体饮食铁缺乏的作用机制是通过影响KDM3A介导的Sry激活过程。在性别决定过程中，铁摄取和Fe²⁺生成通路在发育中的性腺中同时被激活，从而促进KDM3A介导的Sry位点上的H3K9去甲基化。由于Sry的这种表观遗传调控高度依赖于细胞内的Fe²⁺水平，因此母体铁缺乏会导致部分发育中胚胎在子宫内发生由雄性向雌性的性反转。

总结

作者的研究表明，通过药物手段抑制可用铁的供应或给怀孕小鼠喂食低铁饮食，会导致发育中鼠胚在子宫内出现表观遗传状态的改变，损害XY胚胎性腺中Sry基因的激活并引发部分小鼠胚胎由雄性向雌性的性反转。作者的发现首次确立了铁在哺乳动物性别决定过程中的关键作用，并突显出维持孕妇体内足够铁水平的潜在重要性：尤其是那些可能面临缺铁风险的孕妇，以确保胎儿正常的性别分化。

文章来源

https://doi.org/10.1038/s41586-025-09063-2