《食品科学》：中国农业大学薛文通教授等：微生物群落演替对豆酱发酵过程中酪氨酸代谢的影响

豆酱是一种由黄豆、面粉发酵酿制而成的红棕色调味品，在我国食用历史悠久，因其酱香浓郁、鲜咸可口、营养成分丰富等特点而广受消费者喜爱。发酵是一种传统的食品加工和保存方式，微生物群落起到关键作用。在豆酱发酵过程中，微生物分泌的酶先将原料中的大分子物质分解成小分子肽、氨基酸、小分子糖类、有机酸等初级代谢物，再经过微生物代谢或生化反应生成酯类、醛酮类、醇类、生育酚、皂苷等次级代谢物。但是营养成分酪氨酸的积累会形成不好的产品外观，当其浓度超过溶解度时，酪氨酸沉淀，并会在豆酱表面产生直径1～3 mm的白点，严重影响消费者的购买欲望。

随着分子生物技术的发展，高通量测序是研究环境样本中微生物群落组成结构的重要手段，已被广泛应用于发酵领域中的微生物分析。PICRUSt2（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）是一种用于预测微生物功能的计算工具，基于测序数据和已知的微生物基因组信息，推断微生物的功能组成和代谢潜力。

中国农业大学食品科学与营养工程学院金曼芹、罗丹、薛文通*等人通过监测豆酱发酵过程中理化特性的变化，使用高通量测序方法分析微生物群落结构及影响其变化的理化因子，利用PICRUSt2工具中的预测功能分析酪氨酸的代谢途径及酶的注释，探究豆酱微生物的结构组成对酪氨酸产生及沉淀的影响，以期为寻找根除白点的有效方法、提升豆酱品质提供理论参考。

1 豆酱理化特性的动态变化

理化特性是反映豆酱发酵程度及质量评价的重要指标。如图1a所示，pH值随着发酵时间的延长不断降低，56 d后稳定在4.5左右，可以抑制大部分腐败菌的生长繁殖，保证了豆酱的质量和安全性。pH值的下降主要源自于豆酱中总酸含量的上升，在发酵56 d后总酸质量分数在20%～25%之间波动（图1b）。丙酮酸代谢和甘油转化是产生有机酸的重要来源，而有机酸可与醇类结合生成酯类，构建了豆酱的风味特征。如图1c、d所示，豆酱的水分质量分数和盐度在整个发酵过程中变化不大，分别在60%和14 g/100 mL左右波动，说明发酵环境和微生物的活动对豆酱的含水量和盐度影响不大。氨基态氮是评价豆酱品质的主要指标之一，反映豆酱中以游离氨基酸存在的氮含量。如图1e所示，在发酵前14 d内氨基态氮的质量分数增加了3 倍，发酵84 d时其质量分数达到1.5%，符合国标GB/T 24399—2009《黄豆酱》中规定氨基态氮含量≥0.5 g/100 g的要求。还原糖主要用作微生物生长繁殖的碳源和风味成分的前体物质。如图1f所示，在前7 d还原糖含量迅速增加，这是因为淀粉被曲霉属分泌的高活力淀粉酶分解成小分子糖，随后被发酵微生物代谢消耗或参与了美拉德反应，直到发酵56 d后，还原糖质量分数稳定在0.4%。美拉德反应产生的棕色物质使得豆酱在发酵过程中发生颜色变化，可以反映豆酱的发酵进程。如图1g～i所示，豆酱的亮度L*逐渐降低，色调角h变小，即豆酱由亮黄色变为暗红色，但色度值c*变化不大。此外，如图2所示，白点在发酵14 d开始出现在黄豆粒表面，随后在酱醅中也开始出现，随着发酵的进行白点逐渐变厚变大。

2豆酱氨基酸含量的动态变化

氨基酸不仅是豆酱中的营养物质，还是重要的风味物质。不同氨基酸的滋味不同，如谷氨酸和天冬氨酸为鲜味氨基酸，丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸和丙氨酸为甜味氨基酸，而组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、精氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸为苦味氨基酸，这些氨基酸丰富了豆酱的滋味层次。豆酱中常见的氨基酸有17 种，检测这些氨基酸含量后进行聚类分析，结果如图3所示。发酵7 d时，原料中的蛋白质被米曲霉分泌的各种蛋白酶水解，因此几乎所有氨基酸的含量都达到了最高值，在14 d时的含量也相对较高，而在35～84 d期间几乎所有氨基酸的含量都比较低，可能是因为多种微生物（主要是真菌）通过美拉德反应和酶转化消耗了氨基酸。

如表1所示，酪氨酸的质量分数在第7天急剧上升，达到0.95%，而在7～28 d缓慢下降，这是因为中性蛋白酶在第1天活性最大，然后环境因子的变化使得中性蛋白酶活性下降。但是酪氨酸质量分数在28～49 d缓慢上升，在第49天达到0.97%，然后缓慢下降，直到发酵84 d，除了与蛋白酶活性有关，还可能与微生物群落演替和酪氨酸代谢有关。谷氨酸和天冬氨酸是豆酱中重要的呈味氨基酸，其含量会影响豆酱的风味特性。在发酵前7 d，两种氨基酸含量急剧上升，然后缓慢下降至低于发酵初始水平。氨基酸总量在1～7 d急剧上升，因为几乎所有氨基酸含量都上升，然后在7～21 d总氨基酸质量分数从56.87%下降至40.02%，而之后稳定在40%左右。在发酵前7 d，pH值急剧下降，酸性蛋白酶活力增加了4～5 倍，在发酵第49天酶活力最高，是最初酶活力的10 倍。中性蛋白酶最适pH值在6.0～8.0，但是由于发酵过程中pH值除了第1天外均低于6.0，所以中性蛋白酶活力较低，且随着发酵的进行不断降低。

3 微生物群落组成及动态演替分析

3.1

对整个发酵过程中的豆酱样品进行高通量测序，原始数据经过拼接过滤，共得到了3 565 411 个细菌16S rRNA序列和3 717 235 个真菌ITS序列，这些序列经过去重后分别得到了977 个细菌ASVs和1 375 个真菌ASVs，对每个ASV的代表序列进行物种注释和α多样性分析。Chao1指数表示菌种的数目，即群落丰富度，Shannon指数和Simpson指数反映群落的多样性。如图4a所示，细菌的丰富度在发酵7 d时上升到最高，随后又急剧下降，其他的发酵时间内Chao1指数在110附近波动。细菌的Shannon指数和Simpson指数的变化趋势相同，均在发酵前7 d急剧上升，在7～21 d急剧下降，然后分别在21～49 d和49～84 d上升后又逐渐下降。如图4b所示，真菌的丰富度在发酵的1～49 d内缓慢上升，并在49 d达到最高，然后随着发酵时间的继续延长Chao1指数稳定在40附近。真菌的Shannon指数在发酵前7 d无显著变化，在7～14 d急剧上升后开始稳定，直到49 d后Shannon指数缓慢下降。真菌的Simpson指数变化趋势与Shannon指数类似。整体来看，细菌丰富度和多样性指数均高于真菌，且变化趋势比真菌复杂。

3.2 微生物组成分析

豆酱发酵过程中，细菌的优势菌门是厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），其相对丰度分别为32.35%～90.65%和5.29%～67.22%；真菌的优势菌门是子囊菌门（Ascomycota），整个发酵过程中的相对丰度均在90%以上。在属水平上相对丰度排名前15的细菌和真菌如图5所示。优势细菌主要有克雷伯氏菌属（ Klebsiella ）、芽孢杆菌属（ Bacillus ）、四生球菌属（ Tetragenococcus ）、片球菌属（ Pediococcus ）、葡萄球菌属（ Staphylococcus ）、肠球菌属（ Enterococcus ）、魏斯氏菌属（ Weissella ）。克雷伯氏菌属的相对丰度在前21 d从26.92%迅速增加至64.47%，但是在剩下的发酵周期内逐渐降低。芽孢杆菌属的相对丰度在前7 d从49.34%迅速降低至6.51%，在剩下的发酵周期内逐渐上升，在84 d时相对丰度达50.35%。四生球菌属在发酵开始时没有检测出，但是在7～56 d相对丰度快速上升至48.88%，随后开始下降，发酵结束时其相对丰度为30%。片球菌属和葡萄球菌属在发酵前期的相对丰度都比较低，分别为1.56%和0.51%，随着发酵的进行相对丰度逐渐上升，均在70 d达到最大值，分别为14.38%和15.73%。魏斯氏菌和肠球菌属于乳酸菌，在1～28 d相对丰度均呈现下降趋势，随着发酵的进行相对丰度都有所上升，分别在49 d和63 d达到了8.15%和11.72%，但是产生的有机酸使得发酵后期的pH值较低，反而抑制了自身的生长，其相对丰度均下降至1%左右。

曲霉属（ Aspergillus ）和接合酵母属（ Zygosaccharomyces ）都具有耐酸性 ，因此在豆酱发酵阶段都是优势真菌。由于发酵制曲接种了米曲霉，在发酵前7 d曲霉属的相对丰度均超过90%，随着接合酵母属相对丰度在14 d后快速增长，曲霉属的相对丰度减少，在63 d后仅有12%～15%，而接合酵母属相对丰度在70 d后达80%以上。此外，伊萨酵母属（ Issatchenkia ）的相对丰度在发酵开始时很低，仅有0.3%，随着发酵的进行开始缓慢增加，在49 d达到10.9%，但随后开始降低，在63～84 d相对丰度仅为1%～2%。

4 微生物群落与理化特性、氨基酸的相关性分析

豆酱的发酵体系中，微生物的代谢是影响理化特性和酪氨酸产生的主要原因，同时理化特性的变化使微生物发生演替。图6为相对丰度＞0.5%的微生物与理化因子、氨基酸之间的Pearson相关性分析。理化因子中盐度、水分含量和还原糖含量对少数细菌菌属有显著影响，而pH值、总酸含量和氨基态氮含量与细菌、真菌的联系较为密切。pH值与赤水河菌属（Chishuiella）、unidentified_Mitochondria和曲霉属呈显著正相关，与接合酵母属呈显著负相关，而总酸与这些菌属的关系正好相反。此外，总酸与片球菌属和葡萄球菌属呈显著正相关，而与不动杆菌属（Acinetobacter）呈显著负相关。氨基态氮与魏斯氏菌属、赤水河菌属、unidentified_Mitochondria和曲霉属呈显著负相关，与接合酵母属呈显著正相关。在豆酱制曲时，米曲霉作为发酵剂，产生了大量的淀粉酶和蛋白酶，因此还原糖和氨基态氮含量在发酵初期快速上升。还原糖是微生物生长代谢的能源物质，在开放环境下，空气、水、原料或发酵设备中耐盐微生物利用糖类快速繁殖，丰富的微生物组成会代谢产生不同种类的风味代谢物或营养物质。乳酸菌可以在高盐和厌氧环境中生长，通过利用还原糖进行乳酸发酵产生酸类物质，使得发酵体系中的pH值下降，过高的总酸和过低的pH值会抑制不耐酸微生物的生长代谢，由此造成了微生物的α多样性指数在发酵后期逐渐下降。此外，低pH值环境会抑制微生物分泌的酶活性，从而使豆酱中的理化指标和风味代谢物的变化在发酵后期逐渐稳定和平衡。

天冬氨酸和谷氨酸都是豆酱中重要的呈味氨基酸，与相对丰度＞0.5%微生物的相关关系相同，都与肠杆菌属（ Enterobacter ）、沙雷氏菌属（ Serratia ）、不动杆菌属、曲霉属呈显著正相关，与接合酵母属呈显著负相关，由此说明肠杆菌属、沙雷氏菌属、不动杆菌属、曲霉属和接合酵母属是影响豆酱滋味的关键菌种。酪氨酸与微生物的相关性与两种呈味氨基酸有很大的不同，仅分别与芽孢杆菌属、肠杆菌属呈显著负相关和显著正相关。肠杆菌属的相对丰度仅在7 d和49 d高于5%，同时酪氨酸含量在7 d和49 d最高，可以推测肠杆菌属是酪氨酸合成代谢的关键菌种。芽孢杆菌属通常应用于碱性发酵豆制品中，如日本纳豆、韩国Chungkokjang、泰国Thua nao等，芽孢杆菌属被制作成发酵剂，将原料中的蛋白质分解成氨基酸和肽，同时氨被释放，提高了最终产品的pH值，并赋予了食物强烈的氨味 。利用米曲霉作为发酵剂制作的豆酱中，芽孢杆菌属在整个发酵过程中属于优势菌，与氨基酸含量呈负相关，尤其是与酪氨酸呈显著负相关，表明豆酱中的芽孢杆菌属是酪氨酸降解代谢的关键菌种。氨基酸作为各种风味化合物的前体物质，且先前的研究表明接合酵母属能够利用美拉德中间反应产物作为前体增加豆瓣酱的可挥发性物质，因此可以推测豆酱发酵后期氨基酸含量的下降是因为接合酵母属代谢产生其他风味化合物的消耗 。

5 酪氨酸的代谢分析

豆酱中微生物的基因功能预测涉及402 个KEGG三级代谢通路，包括参与细胞和生物过程的各种途径。酪氨酸代谢途径的预测结果主要是酪氨酸生物合成途径和酪氨酸降解途径I，代谢途径中主要化合物和酶如图7所示。来自糖酵解的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和戊糖磷酸途径的赤藓糖-4-磷酸（E4P）缩合形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP），之后去磷酸化、脱水、与水加成后生成莽草酸（SA）；SA是生成芳香族化合物的关键中间体，经过磷酸化后与PEP反应，再去磷酸化后形成了分支酸（CA）；CA经酶催化变位、脱氢生成对羟基苯丙酮酸（4-HPPA），转氨后形成酪氨酸。酪氨酸可能直接代谢为酪胺和苯酚，也可能通过间接代谢成红景天苷、琥珀酸、延胡索酸和乙酰乙酸等化合物。在豆酱发酵时，酪氨酸脱氨成4-HPPA，随后4-HPPA的侧链丙酮酸氧化脱羧以及苯环邻位羟化，生成了尿黑酸（HGA），HGA被氧化，苯环断裂成马来酰乙酰乙酸（MAA），再经过异构酶催化成延胡索酰乙酰乙酸（FAA），最终FAA被水解成延胡索酸和乙酰乙酸。

如图8所示，酪氨酸生物合成途径的功能基因相对丰度远高于酪氨酸降解途径I。酪氨酸的含量变化与酪氨酸生物合成途径功能基因相对丰度有很大的关系，即相对丰度在1～7 d和42～49 d明显增加，同时酪氨酸含量在发酵7 d和49 d显著高于其他发酵时间，而在发酵63 d后相对丰度显著降低，酪氨酸含量也在缓慢降低。第56天酪氨酸生物合成途径功能基因相对丰度最低，可能是发酵49 d后过高的酪氨酸含量反馈抑制了该途径的某些酶活性，如EC: 5.4.99.5。酪氨酸降解途径I的功能基因相对丰度在整个发酵阶段呈现下降趋势，发酵前14 d明显下降后就维持在一个很低的水平上。酶是酪氨酸代谢的重要参与者，催化各种生化反应，调控酪氨酸的合成和降解，因此编码有关酪氨酸代谢酶的基因是酪氨酸代谢的主要功能基因，其相对含量如图9所示。酪氨酸生物合成途径相关的酶编码基因相对含量在第1天较低，在第7天相对含量增加，而在发酵63 d后大部分酶的编码基因相对丰度比较低。酪氨酸降解途径相关的酶编码基因在第1天和第7天相对丰度均比较高，之后发酵时间内相对丰度比较低，所以其相应途径的功能基因相对丰度自豆酱发酵14 d后很低。

酪氨酸是很多重要芳香物质的前体，研究酪氨酸与具体微生物的关系及代谢通路，将其转化成其他化合物，可能会彻底解决白点问题同时不影响豆酱的风味特性。在本研究中，酪氨酸的含量与芽孢杆菌呈显著负相关，即使芽孢杆菌属在整个发酵阶段都是优势菌群，但是酪氨酸降解功能基因的相对丰度仅在发酵前7 d较高，因此可筛选出高效降解酪氨酸的芽孢杆菌菌种。此外，Tong Wenhua等发现白酒大曲中的酪氨酸经过微生物分泌的酪氨酸解氨酶（TAL）催化脱氨生成对香豆酸，再经过4-羟基苯乙酸酯-3-羟化酶羟化生成咖啡酸，对香豆酸和咖啡酸都是酚类物质，对人体具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等诸多药理作用，TAL能否催化豆酱中酪氨酸生成对香豆酸还需要进一步探究，以此为减少白点提供新的途径。

结论

本研究分析了豆酱在不同发酵时间内酪氨酸含量变化及微生物群落演替。结果表明，在整个发酵过程中，酪氨酸在发酵7 d和49 d含量最高，白点在前14 d内开始出现，随后逐渐变大变厚。细菌的α多样性在发酵前期较高，真菌在发酵中期较高，但在发酵后期由于总酸含量上升、pH值下降，细菌和真菌的α多样性均显著下降。同时，对豆酱微生物相关性和酪氨酸代谢途径的分析表明，肠杆菌属在整个发酵过程具有较高的酪氨酸合成潜力，芽孢杆菌属仅在发酵初期具有较高的酪氨酸降解潜力，主要原因是不同发酵时间参与酪氨酸代谢功能酶的基因表达程度不同。总之，本研究深入了解了酪氨酸与豆酱微生物群落的相关性，揭示了酪氨酸在豆酱发酵过程中的初步代谢机制，为未来解决豆酱白点问题、提升产品品质提供了理论基础。然而，对于本研究提出的酪氨酸降解功能菌株，后续实验还需要进一步探索其模拟发酵和生物强化手段，以便更详细地了解豆酱发酵过程中酪氨酸的具体形成，为解决白点问题提供理论和实践依据。

作者简介

通信作者：

薛文通，男，中共党员，工学博士，中国农业大学食品科学与营养工程学院教授、博士生导师，中国农业大学中日食品研究中心主任，兼任农业农村部农产品加工业专家委员会和标准化委员会委员，中国农业工程学会农产品加工贮藏分会副理事长，中国食品和包装机械工业学会中央厨房工程与装备委员会副会长等。长期从事食品科学与营养工程方面的教学和科研工作。迄今主持/参与“食物过敏标识的风险评估技术研究”等国家重点研发计划项目6 项，国家自然科学基金项目6 项，省部级研究项目24 项等。主要研究领域: 食品加工与贮藏保鲜工程、食品安全及功能性食品研究、预制菜肴加工技术及中央厨房工业化等方面的研究。在国内外学术期刊上发表论文280余篇，授权国家发明专利16 项，主参编教材和著作14 部，其中《食品工厂设计与设备》入选国家首批“十四五”规划教材。获省部级及以上奖励8 项。

第一作者：

金曼芹，女，中国农业大学食品科学与营养工程学院食品科学与工程专业硕士研究生，研究方向：传统酱制品的微生物分析和风味品质提升，发表核心学术论文2 篇，申请国家发明专利1 项，参与国家级、省部级科研项目2 项，多次获国家励志奖学金、校硕士学业一等奖学金、优秀毕业生等荣誉。

本文《微生物群落演替对豆酱发酵过程中酪氨酸代谢的影响》来源于《食品科学》2025年46卷第3期64-73页，作者：金曼芹 ，罗丹 ，王刚兔 ，李奕欣 ，裴伟 ，薛文通。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240510-080。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

为贯彻落实《中共中央国务院关于全面推进美丽中国建设的意见》《关于建设美丽中国先行区的实施意见》和“健康中国2030”国家战略，全面加强农业农村生态环境保护，推进美丽乡村建设，加快农产品加工与储运产业发展，实现食品产业在生产方式、技术创新、环境保护等方面的全面升级。由 中国工程院主办， 中国工程院环境与轻纺工程学部、北京食品科学研究院、湖南省农业科学院承办， 国际食品科技联盟（IUFoST）、国际谷物科技协会（ICC）、湖南省食品科学技术学会、洞庭实验室、湖南省农产品加工与质量安全研究所、中国食品杂志社、中国工程院Engineering编辑部、湖南大学、湖南农业大学、中南林业科技大学、长沙理工大学、湘潭大学、湖南中医药大学协办的“ 2025年中国工程院工程科技学术研讨会—推进美丽乡村建设-加快农产品加工与储运产业发展暨第十二届食品科学国际年会”，将于2025年8月8-10日在中国 湖南 长沙召开。

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