FSHW | 大豆多糖通过调节肠道菌群和肠上皮再生来维持结肠稳态，以防止葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎

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Introduction

炎症性肠病（IBD）是一种复发性和慢性胃肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。在过去的半个世纪里，IBD在世界范围内普遍存在。临床和临床前研究结果表明，靶向肠道微生物群及其代谢物在预防和治疗结肠炎中起着关键作用。产乳酸菌的消失与结肠炎的恶化有关。研究表明，乳酸是产乳酸菌代谢与宿主细胞上的受体相互作用以维持宿主健康的关键副产品。代谢物的丰度和微生物组的组成受饮食因素的调节。增加富含益生元的天然产品的消费可能有助于通过维持肠道健康来预防和缓解炎症性疾病。虽然确切的机制尚不清楚，但益生元和微生物群之间的相互作用与有益效果有关。

大豆多糖（SP）是一种膳食纤维，通常用作功能性食品添加剂。商业SP通常从豆渣中提取，豆渣是豆腐和豆浆生产过程中产生的一种丰富且廉价的副产品。SP主要由半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和木糖组成，分子量5×103～1×106 Da不等。对SP的研究伴随着对其生物活性的兴趣增加，例如免疫调节活性、抗氧化活性、抗肥胖活性、修复辐射损伤。最近的一项体外研究表明，SP对肠道微生物的组成具有有益的调节作用。然而，SP是否对结肠炎有保护作用及其潜在的分子机制尚不清楚。

因此，在本研究中研究了SP对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型的缓解作用。确定隐窝损伤和杯状细胞数量以测试肠道屏障的完整性。考虑到SP影响肠道微生物群，探索了SP调节肠道微生物组成和微生物群衍生代谢物的能力，这与影响肠道干细胞的增殖有关。因此，本研究结果旨在为SP在结肠炎预防中的潜在应用提供新的思路。

Results and Discussion

膳食SP减轻DSS诱导的实验性结肠炎

为了研究SP对肠道功能的影响，利用DSS诱导的结肠炎模型。如上所述，给予小鼠蒸馏水或SP（400 mg/kg）。第25天，用饮用水中的2% DSS处理小鼠以诱导急性结肠炎，并在5 d后实施安乐死（图1A）。评估了SP对DSS治疗期间结肠炎相关症状以及体质量变化的影响。与DSS组相比，补充SP保护动物免受DSS诱导的体质量减轻（图1B）。SP显著抑制了疾病活动指数评分（DAI，与体质量减轻、大便稠度和直肠出血有关的综合评分）的增加（图1C）。补充SP导致结肠炎改善，结肠延长增加明显（图1D和E）。此外，SP喂养小鼠的脾脏肿大得到改善（图1F和G）。盲肠重量不受SP处理的显著影响（图1H）。与DSS处理的小鼠相比，反映中性粒细胞浸润的SP处理小鼠结肠中的MPO活性降低（图1I）。综上所述，这些结果表明SP在结肠炎动物模型中具有保护作用。

SP改变了免疫细胞谱和巨噬细胞极化以减轻炎症环境

炎性细胞因子和免疫细胞的异常激活是结肠炎发生和发作的关键因素。为了揭示SP对全身和肠道炎症反应的保护作用，评估了血浆和结肠中的促炎细胞因子水平。SP喂养显著降低了DSS处理小鼠血浆中白细胞介素IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子TNF-α的循环水平（图2A-C）。同样，DSS暴露导致结肠炎症标志物IL-1β、IL-6和TNF-α显著升高，而SP预处理成功地减少了结肠组织中促炎细胞因子的分泌（图2D-F）。除了抑制M1巨噬细胞产生的促炎细胞因子的分泌外，SP处理后M1巨噬细胞标志物Cd86、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和单核细胞化学引诱蛋白-1（MCP-1）的转录也显著降低（图2G-I）。此外，在SP补充小鼠的结肠中，炎症区1（Fizz1）中发现的M2标记物Cd206、精氨酸酶1（Arg1）的产生也上调（图2J-L）。还观察到DSS组结肠组织中Cd11b的显著增加，而SP处理抑制了Cd11b的表达（图2M）。同样，SP小鼠的Cd45和Cd3的mRNA水平下调（图2M）。此外，SP补充小鼠抗炎因子、转化生长因子(Tgf)-β和IL-10 mRNA表达上调（图2N）。综上所述，SP可抑制DSS诱导的巨噬细胞向促炎型巨噬细胞分化，维持结肠微环境的促炎与抗炎平衡。

SP预处理可防止结肠上皮损伤

肠道屏障缺陷是结肠炎的主要病理特征，导致细菌抗原或细菌渗漏。接下来，将重点关注结肠屏障完整性，以更好地了解SP对屏障功能的影响。组织学分析显示，SP减轻了结肠中的隐窝损伤、炎性细胞浸润和总体组织学评分（图3A-C）。正如预期的那样，观察到SP预处理明显降低了DSS诱导的FITC-葡聚糖通量（图3D）。在组织学分析中检测了含SP的饮食对结肠杯状细胞的影响。AB染色显示，SP处理的小鼠杯状细胞数量增加（图3E和F）。SP优先增强杯状细胞标志物，包括mucin2（Muc2）和Muc4（图3G和H）。免疫组化（IHC）染色分析封闭带-1（ZO-1）进一步证实SP喂养的小鼠上皮屏障增强（图3I）。一致地，SP喂养使ZO-1、occludin和claudin-4的mRNA水平正常化，它们是紧密连接相关蛋白的重要组成部分，在维持肠道稳态中起着至关重要的作用（图3J-L）。综上所述，这些结果表明补充SP可以预防DSS引起的结肠损伤。

SP调节肠道微生物组的组成

鉴于肠道菌群与IBD有关，接下来研究了SP喂养是否影响微生物生态系统以及微生物群组成的变化是否与其对DSS诱导的结肠炎的保护作用有关。为了探讨SP对肠道菌群组成的影响，对粪便进行了16SrRNA基因测序。Chao1指数显示SP影响肠道微生物组结构的丰富度（图4A）。于UniFrac的PCoA证实，DSS组整体肠道菌群结构与对照组明显不同（R2＝0.6107，P＝0.004）（图4B）。SP组小鼠粪便菌群结构与DSS组差异有统计学意义（R2＝0.5653，P＝0.003）。门水平分析表明，拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门在DSS组的粪便微生物群中占主导地位，而厚壁菌门、拟杆菌门和髌骨菌门为是SP处理小鼠的优势门（图4C）。DSS显著提高了变形菌门的水平，而变形菌门的水平被SP处理显著抑制（图4D）。在科水平，观察到SP处理阻止了肠杆菌科DSS驱动的升高（图4E-G）。三元图分析显示，肠杆菌科是微生物群失调的常见特征，是DSS组中高度丰富的细菌类群（图4F）。乳酸菌科（已知有利于保护肠道屏障功能）通过SP处理特别丰富（图4E-G）。然后，分析了属水平的肠道细菌组成。SP处理小鼠的主要细菌分类群与DSS组不同（图4H）。在属水平上，发现异杆菌属、毛螺菌属和埃希氏菌属在DSS组中富集，而乳酸菌、毛螺菌属_UCG-006和瘤胃球菌在SP处理的小鼠中富集（图4H）。值得注意的是，SP处理的小鼠粪便微生物群中的主要属是乳酸菌，其丰度约为40%（图4H和I）。乳酸菌的丰度解释了SP与DSS相比，在肠道微生物群中发现的厚壁菌门的大部分升高。使用Student’s t-检验对SP处理和DSS处理的小鼠进行细菌分类。Student’s t-检验还确定乳酸菌是区分SP小鼠和DSS小鼠细菌分类群的主要特征（图4I），表明SP是一种良好的益生元，可促进有益菌，尤其是乳酸菌的生长。总体而言，SP逆转了肠道菌群失调并改变了肠道微生物组的组成。

SP促进肠道菌群衍生代谢物的产生和活性

随后，研究乳酸菌的丰度是否会影响其代谢物和代谢活性。在测试的4只SCFA中，SP处理的小鼠比DSS组小鼠表现出更高的丁酸浓度的趋势（P＝0.054）（图5A）。胆汁酸，如氯氧化胆酸（CDCA），胆酸（CA），岩性酸（LCA）和脱氧胆酸（DCA）不受SP处理的影响（图5B）。此外，通过RT-qPCR量化了SCFA相关基因的丰度，发现游离脂肪酸受体Ffar2和Ffar3的表达没有被SP显著上调（图5C）。Farnesoid X受体（FXR）和G蛋白胆汁酸受体（GPBAR1，也称为Tgr5）的结肠mRNA表达在SP小鼠中不受影响（图5D）。虽然SP小鼠的粪便SCFA和BAs浓度没有显著变化，但SP喂养小鼠粪便中乳酸的相对丰度明显更高（图5E）。与较高的乳酸比例一致，膳食SP产生的乳酸充分增强了其受体基因G蛋白受体（Gpr）的表达81（图5F）。Gpr81是维持肠上皮再生的重要因子。SP通过显著增加Wnt3的mRNA水平来激活Wnt/β-catenin通路，进一步支持上皮再生，这也通过增加β-catenin表达得到进一步证明（图5G和H）。免疫荧光（IF）分析显示SP喂养小鼠中β-catenin阳性细胞较高（图5I）。此外，抗生素介导的肠道菌群耗竭显著抑制了SP的调节作用，强烈表明SP根据肠道菌群刺激Gpr81信号通路（图5J）。还探索了乳酸在肠道类器官模型中的功能。发现乳酸处理激活了Wnt/β-catenin通路，增加了Wnt3和β-catenin的蛋白表达，这被Gpr81拮抗剂3-OBA和Wnt拮抗剂Wnt-C59抑制（图5K和L）。总体而言，SP的预处理调节了产乳酸细菌的功能。

SP促进肠道干细胞（ISC）分化

由于Gpr81/Wnt/β-catenin通路已被证明可调节ISCs的增殖和再生，随后测试了肠道微生物群中SP诱导的变化是否与宿主ISCs的影响有关。事实上，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检查显示，结肠上皮细胞凋亡由DSS驱动，并因SP而显著改善（图6A）。一致地，SP处理显著抑制了结肠中凋亡标志物裂解的Caspase-3（图6B和C）。存活信号通路，p38磷酸化在SP喂养的小鼠中同时上调（图6B和D）。Western blotting和RT-qPCR显示，与DSS组相比，SP喂养小鼠的Lgr5水平（主要的ISC库）上调（图6B、E和F）。对结肠炎小鼠进行SP治疗导致溶菌酶（lyz）1表达数量增加（图6G）。经预处理的SP的DSS结肠炎小鼠上调结肠中增殖信号Ki-67的表达（图6H和I）。同时，Spearman相关分析发现乳酸菌科、乳酸和Gpr81与ISCs的肠道屏障和再生呈正相关（图7）。总的来说，这些发现表明SP喂养导致对ISCs增殖的正反馈以维持肠道稳态。

SP治疗小鼠肠道微生物群移植减轻DSS诱导的结肠炎

为了研究SP对小鼠结肠炎的有益影响是否由微生物群介导，将未经处理和SP处理的小鼠的粪便微生物群移植到食物喂养的小鼠中25 d，然后进行2% DSS。实验设计如图8A所示。移植SP调节的微生物群显著减少了DSS给药第5天的身体损失（图8B）。SP-FMT小鼠的结肠缩短得到改善（图8C和D）。此外，SP-FMT小鼠发生较轻的严重结肠炎（图8E）。结肠炎症标志物包括IL-1β和IL-6，在SP-FMT小鼠中显著下调（图8F和G）。透射电子显微镜检查显示杯状细胞中SP-FMT小鼠中大黏蛋白颗粒计数高，表明杯状细胞中黏蛋白的生物发生和积累增强（图8H）。还观察到SP调节的微生物群移植保护了DSS诱导的小鼠结肠紧密连接和刷状缘的超微结构破坏（图8I）。同样，移植SP调节的微生物群增加了与维持黏膜屏障相关的基因的表达，例如ZO-1、Occludin、Muc2和Tff3（图8J-M）。因此，这些结果表明肠道菌群有助于SP预防结肠炎。

Conclusion

总之，目前的研究发现SP治疗可有效预防小鼠模型中DSS诱导的结肠炎。SP通过Wnt/β-catenin通路促进结肠干细胞增殖和分化，改善肠道屏障功能，部分原因是介导微生物群组成和促进微生物群衍生乳酸的产生。这些发现对SP在结肠炎和其他炎症性疾病中的应用具有意义。

Soy polysaccharide maintains colonic homeostasis to protect from dextran sulphate sodium-induced colitis by modulating gut microbiota and intestinal epithelial regeneration

Nana Zhanga, Jianlin Liua, Weiyue Zhanga, Xinxin Guoa, Shuying Lia, Hongtai Zhanga, Minjie Wangb, Bei Fana, Fengzhong Wanga,*

a Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100095, China

b School of Basic Medical Sciences, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010107, China

*Corresponding author.

Abstract

Soy polysaccharide (SP) has been reported to possess the properties of modulating gut microbiome diversity. Here, we aimed to explore the protective effects of SP against dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis. Pre-treatment with SP at a dosage of 400 mg/kg·day alleviated colitis symptoms, preventing the weight loss and colon shorten. SP suppressed DSS-induced inflammatory response and enhanced M1 to M2 macrophage polarization. Further investigation showed that SP significantly promoted the regeneration of crypt and the expansion of goblet cell production. In addition, bacterial 16S rRNA sequencing analysis showed that SP modulated the composition of fecal microbiota, including selectively increasing Lactobacillus relative abundance. Notably, SP treatment enriched the production of Lactobacillus-derived lactic acid, which was sensed by its specific G-protein-coupled receptor 81 (Gpr81)/Wnt3/β-catenin signaling, and promoted the regeneration of intestinal stem cells. Fecal microbiome transplantation demonstrated that intestinal flora partially contributed to the beneficial effects of SP on preventing against colitis. In conclusion, SP exhibited the protective effects against colitis, which could be partly associated with modulating the composition of gut microbiota and enrichment of lactic acid. This study suggests that SP has potential to be developed as nutritional intervention to prevent colitis.

Reference:

ZHANG N N, LIU J L, ZHANG W Y, et al. Soy polysaccharide maintains colonic homeostasis to protect from dextran sulphate sodium-induced colitis by modulating gut microbiota and intestinal epithelial regeneration[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3284-3300. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250015.

翻译： 陈文静（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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