CHO 细胞乳酸转换：影响生物制药的关键密码

摘要：本文聚焦于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中乳酸转换现象，深入剖析驱动其从乳酸产生向乳酸消耗转变的分子机制，探讨了单羧酸转运蛋白、乳酸脱氢酶、丙酮酸浓度、糖酵解通量、氧化还原平衡及线粒体活性等因素的影响。同时，介绍了通过代谢工程、培养基和过程控制、细胞系选择等方法控制乳酸转换的策略，提出细胞氧化还原状态可能是触发乳酸转换的关键因素，为优化 CHO 细胞培养工艺提供参考。

一、引言

在生物制药市场蓬勃发展的背景下，CHO 细胞作为生产治疗性蛋白质的主力军，其代谢过程备受关注。CHO 细胞代谢随培养过程和营养供应变化，通常细胞代谢分为糖酵解和氧化磷酸化两种类型，而在实际中多数细胞会根据环境在两种代谢方式间切换。在 CHO 细胞培养过程中，一个重要的代谢转变是从乳酸产生到乳酸消耗的转换，这一转换对细胞生长和生产效率意义重大，不仅能防止培养基酸化、维持渗透压稳定，还与高生产率紧密相关。然而，尽管该现象常见，但具体发生机制仍不明确。

二、乳酸转换的分子机制

2.1 单羧酸转运蛋白（MCT）的作用

MCT 负责乳酸进出细胞，其调节主要发生在表达水平。研究表明，MCT 表达会因外界刺激改变，在 CHO 细胞中，AMPK 和 PGC1α 可能参与 MCT1 的转录调控。MCT 的活性则取决于细胞膜两侧乳酸和 H⁺的相对浓度（图 1）。在培养初期，细胞内乳酸和 H⁺浓度高，乳酸被排出细胞，随着培养基中碱的添加维持 pH 梯度，乳酸持续排出。当细胞内 H⁺浓度下降或细胞内乳酸浓度低于细胞外时，乳酸开始被细胞摄取消耗。

2.2 LDH 同工酶与表达

乳酸需经 LDH 氧化为丙酮酸才能重新进入代谢，因此 LDH 的调节可控制乳酸与丙酮酸之间的代谢通量。LDH 有三种基因，编码不同的同工酶，各同工酶因对丙酮酸和乳酸的亲和力不同，具有不同的动力学特性（图 2）。在 CHO 细胞中，LDH 的主要形式尚无定论，不同研究报道存在差异。LDH 基因表达在多种生理和病理过程中会发生变化，在 CHO 细胞培养中，其表达也可能影响乳酸转换。

2.3 LDH 的翻译后修饰

LDH 的翻译后修饰，如磷酸化和乙酰化，会影响其活性。磷酸化促进蛋白四聚体组装和对 NADH 的亲和力，乙酰化则抑制其活性并促使降解。在 CHO 细胞中，LDH 翻译后修饰状态的瞬时变化可能改变乳酸产生速率，但能否完全逆转 LDH 活性尚不明确。

2.4 乳酸与丙酮酸的关系

由于 LDH 反应接近平衡状态，其底物的相对浓度是驱动反应方向的主要因素。通常细胞内 NAD⁺/NADH 和乳酸 / 丙酮酸存在一定比例，当丙酮酸或 NADH 水平升高，反应向生成乳酸方向进行；反之，乳酸或 NAD⁺水平升高，反应逆向进行。尽管有研究认为乳酸浓度可能是转换驱动因素，但实际情况复杂，且乳酸浓度变化往往依赖于丙酮酸、NAD⁺和 NADH 浓度的改变。此外，丙酮酸参与多种代谢途径，其浓度受其他反应影响，当丙酮酸被其他途径消耗时，会促使 LDH 逆向反应，引发乳酸消耗。

2.5 糖酵解通量控制

糖酵解通量影响细胞内丙酮酸浓度，进而影响乳酸代谢。高糖酵解通量会导致丙酮酸积累，促使乳酸生成；通量下降时，丙酮酸池减少，乳酸被用于补充丙酮酸。糖酵解通量受多种酶的调控，如己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，这些酶可通过反馈抑制等方式调节通量。此外，葡萄糖转运蛋白 GLUT1 表达、营养供应等也会影响糖酵解通量，进而影响乳酸转换。虽然营养缺乏有时会引发乳酸转换，但该现象也会在营养充足时发生，说明营养缺乏并非唯一决定因素。

2.6 氧化还原平衡

NAD⁺和 NADH 作为 LDH 的底物，细胞的氧化还原状态对乳酸代谢反应方向至关重要。高糖酵解通量产生过量 NADH 时，LDH 将丙酮酸还原为乳酸以再生 NAD⁺；糖酵解通量降低后，NADH 水平下降，乳酸被消耗以恢复平衡。研究表明，在乳酸消耗过程中，NADH 可通过苹果酸 - 天冬氨酸穿梭进入线粒体，且乳酸转换后细胞的氧化磷酸化水平增加。此外，CHO 细胞中甘油积累现象也支持了氧化还原平衡与乳酸代谢的关联，细胞可能通过相关反应维持 NAD⁺水平。

2.7 线粒体活性

线粒体功能与细胞氧化还原状态密切相关，进而影响乳酸转换。当糖酵解与线粒体活动不平衡时，乳酸可作为补充 NADH 的方式被消耗。例如，铜缺乏会抑制乳酸转换，因为铜是线粒体电子传递链复合物 IV 的关键成分，缺乏铜会削弱电子传递链功能，降低对 NADH 的需求，导致乳酸不被消耗。此外，上调抗凋亡基因 BCL2 可促进乳酸消耗，伴随线粒体酶活性增加，说明刺激线粒体功能可改变丙酮酸和 NADH 水平，推动乳酸转换。

2.8 总结

综合来看，乳酸转换存在多种潜在控制机制，但基于相关研究，转录变化不太可能是乳酸转换的初始驱动因素，因为其响应速度较慢，无法解释快速的乳酸转换现象。而细胞的氧化还原状态最有可能触发乳酸转换，它能快速改变 LDH 反应通量，使 LDH 作为氧化还原传感器发挥作用，并且与其他影响乳酸转换的因素相关联。当细胞代谢表型稳定后，可能会通过调整蛋白质组适应新的代谢状态。

三、控制乳酸转换的方法

3.1 代谢工程

通过基因工程改造细胞代谢途径是控制乳酸转换的常用方法。针对乳酸积累问题，可敲除或下调 LDH 基因，但这可能限制糖酵解通量；也可将丙酮酸分流到其他途径，如过表达酵母丙酮酸羧化酶（PYC），可减少乳酸产生，提高代谢效率，但对细胞生长和生产的影响存在差异；上调丙酮酸脱氢酶（PDH）活性、过表达苹果酸脱氢酶 2（MDH2）等方法也被尝试用于减少丙酮酸积累，促进乳酸消耗，但效果不一。此外，利用替代碳水化合物、使细胞抗凋亡等策略也可影响乳酸代谢，不过在研究中需考虑细胞群体的异质性。

3.2 培养基和过程控制

改变细胞的细胞外环境，包括培养基成分和培养过程控制参数，可调节细胞代谢。使用代谢较慢的糖类替代葡萄糖，如半乳糖、果糖等，或控制葡萄糖水平，可降低糖酵解通量，减少乳酸积累。通过 pH 控制葡萄糖进料、在线实时监测代谢物等技术，可更精准地调控培养过程。此外，添加铜等补充剂可影响细胞代谢平衡，但改变培养基成分可能影响产品质量，需权衡利弊。调整培养基 pH 和温度也可影响乳酸转换，不过低温单独作用通常不足以完全实现转换。

3.3 细胞系选择

由于不同细胞在相同培养条件下的乳酸代谢表型存在差异，优化细胞系选择过程可筛选出具有良好代谢表型的细胞。例如，根据线粒体膜电位筛选细胞，可获得乳酸产生率低、生长更好的亚克隆，说明线粒体功能与乳酸代谢相关，可作为细胞系选择的潜在标记。优化细胞系筛选虽面临一些技术和成本挑战，但从长远看，有助于提高生产效率。

3.4 总结

目前已有多种方法用于控制乳酸转换，但各有优缺点和适用范围。由于 CHO 细胞的基因组不稳定和转录组变化大，实验结果存在差异，且部分研究使用专有培养基和在不同培养条件下进行，结果难以推广。考虑到细胞在培养过程中不同阶段的需求不同，未来双相培养方法可能更受欢迎，通过调整进料设计和利用可诱导基因开关，可根据培养阶段优化细胞生长和生产效率。

四、结论

明确乳酸转换的具体原因对开发针对性控制策略、统一研究结果至关重要。借助已有的基因组和微阵列技术，未来有望鉴定出乳酸转换的潜在标记。此外，研究其他存在乳酸穿梭现象的系统，如脑组织和肿瘤微环境，对比分析相关细胞，可能为揭示 CHO 细胞乳酸转换机制提供新线索。本文提出细胞氧化还原状态触发乳酸转换的假设，该状态可作为乳酸消耗转换的关键因素，后续研究可进一步验证和完善这一理论，以优化 CHO 细胞培养工艺，提高生物制药生产效率。

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