纳米抗体！哒~哒~哒~

纳米抗体简介

纳米抗体（Nanobody，Nb）的发现源于单峰骆驼的单链抗体（重链抗体，HcAb），单链抗体的结构和传统的IgG结构不同，缺乏轻链和CH1结构。

把单链抗体的抗原识别结构域（VHH）单独拿出来即为纳米抗体。这种单结构域抗体分子量要小得多（约15kDa），是IgG抗体分子量的十分之一左右，是抗体scFv结构的二分之一。

结构特点

纳米抗体VHH和scFV的VH结构类似，由9条β链组成，形成典型的IgV 折叠。

不同的是，在FR2区中，传统的FR2由四个高度保守的疏水氨基酸（Val37、Gly44、Leu45 和 Trp47）组成，它们与Gln39、Gly44、Tyr91和Trp103形成保守疏水界面，以促进VL连接。

但VHH中不存在VL，因此这四个疏水残基被亲水性氨基酸（Phe37、Glu44、Arg45和Gly47）取代，以免疏水区暴露于溶液中。

除此外，VHH的CDR3有额外延长的氨基酸（26个 VS 9-15个），细长的CDR3可延伸到scFV几乎无法接近的表位中。

但扩大的氨基酸序列使得CDR3更具柔韧性，影响了和抗原的亲和。为解决这个问题，VHH的CDR1和CDR3形成了额外的二硫键。

这些特殊的结构，使得VHH具有高效组织渗透、高稳定性、耐极端条件、高溶解度等优点，特别擅长识别和结合某些表位，偏爱非平面表位，如空腔和凹槽，能够高精度地靶向这些区域。

理化特性

纳米抗体具有非常理想的理化特性！

VHH在4°C和-20°C下的保质期长、耐受高温（60-80°C）和蛋白水解、耐受非生理pH（3.0-9.0）、耐受高压（500-750 MPa）。

当暴露于化学变性剂（如，2-3M氯化胍、 6–8M尿素）时，对其抗原结合能力的影响不大。

筛选和生产

纳米抗体的获得来源于免疫文库、天然或人工合成文库。

免疫文库通过用靶抗原对骆驼科动物或转基因小鼠进行免疫产生的。

免疫成功后从动物中提取血液，纯化淋巴细胞用于cDNA文库构建，理想的免疫文库包至少得有107的容量。

库容越大，找到具有强特异性和高亲和力的高亲和力结合物的纳米抗体的可能性越大。

合成文库和天人文库不需要免疫动物，适合在VHH抗原可能无法引起免疫反应或对动物危害太大的非免疫原性或毒性分子相比下，免疫文库经历体内亲和成熟，比合成文库具有更高的亲和力和特异性。

在文库合成后，通过“展示技术”对文库中的抗体序列进行高通量筛选。最常用的是噬菌体展示，除此外酵母展示还具有一些差异化的优势，还有一些别的筛选方式供选择。

纳米抗体药物

目前，已有四种基于纳米抗体的药物得上市批准。

Caplacizumab由两个靶向vWF特异性的纳米抗体，通过多肽链融合而成。

Ozoralizumab 由两个相同的TNFα 特异性纳米抗体通过多肽与一个位于中央的白蛋白特异性纳米抗体融合而成。白蛋白纳米抗体起到延长药物的半衰期的作用。

Ciltacabtagene是靶向BCMA双表位的纳米抗CAR-T。

Envafolimab 是在中国上市的PD-1药物，使用靶向PD-1的VHH和Fc偶联。

除此外，还有大量采用纳米抗体结构的药物处于临床试验阶段!

在使用纳米抗体作为药物开发的结构时需要考虑几点：（i）人源化，以减少潜在的免疫原性；（ii）半衰期需要改良；以及（iii）药物的给药途径。

纳米抗体的人源化通常设计对FR2区域的氨基酸修改，该区域有四个关键氨基酸和人VH关键氨基酸有差异。已上市药物的的人源化修改，参见上图。

在半衰期延长方面，可以采用偶联HSA纳米抗体和Fc结构的方式。

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