探索HCC免疫耐药机制，CRKL抑制剂联合抗PD-1疗法有望开发用于HCC治疗

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探索免疫耐药难题，提供临床诊疗新思路。

一篇题为《CRKL通过介导肝细胞癌中肿瘤相关中性粒细胞浸润导致对PD-1抑制剂的耐药性》(IF:26.8)[1]，发表于《

Journal of Hepatology

图1 研究概述图

研究背景

HCC是全球癌症相关死亡的第三大原因，尽管HCC治疗疗效已有显著改善，但大多数HCC患者就诊时已为中晚期，丧失手术切除机会。免疫检查点抑制剂（ICIs）的出现为肿瘤治疗带来了翻天覆地的变化，在肝癌领域，根据Ⅲ期临床试验IMBrave150的积极结果，阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗已成为晚期HCC患者一线标准疗法之一。然而，其他针对HCC患者的抗PD-1疗法的随机临床试验（KEYNOTE-240和CheckMate-459）并未显示出疗效的显著改善，这表明可能存在某种机制塑造了HCC复杂的免疫抑制微环境，进而导致患者对PD-1疗法产生耐药性。因此，需要进一步探索生物标志物以优化患者治疗选择并克服免疫治疗耐药性。

中性粒细胞是人体中最丰富的循环白细胞，并在多种癌症类型中积聚。肿瘤中的中性粒细胞表现出显著的可塑性，并且已被证明能够在T细胞炎症微环境中获得抑制T细胞的能力。中性粒细胞通过释放抗肿瘤因子如TSP-1和过氧化氢，可能表现出抗肿瘤效应，抑制肿瘤进展，并在免疫治疗后获得抗肿瘤表型。肿瘤相关中性粒细胞（TANs）在多种实体瘤中具有促进肿瘤的作用，强调了TANs在塑造免疫抑制性肿瘤微环境（TME）和免疫治疗耐药性中的关键作用。CRKL是一种位于人类22q11.21染色体上的适配器蛋白，参与多种生物学过程。CRKL在多种癌中表达升高，且其扩增可驱动癌变和表皮生长因子受体抑制剂耐药性。因此，该研究探索了CRKL在HCC中对抗PD-1耐药性中的潜在作用。

研究方法

患者与样本

• 队列1：纳入2019年8月至2021年12月在上海复旦大学附属中山医院接受抗PD-1治疗的32名不可切除HCC患者的32例标本。依据mRECIST标准，部分缓解（PR）指靶病灶最长直径总和至少减少30%，疾病进展（PD）指靶病灶最长直径总和至少增加20%且绝对增加至少5毫米。通过MRI评估治疗疗效，并对5名反应者和5名非反应者的治疗后HCC组织进行RNA测序。

• 队列2：随机选取2019年6月至2021年3月在复旦大学附属中山医院接受根治性切除术的35名HCC患者的标本，用于测量CRKL蛋白表达及CRKL、β-catenin、VEGFa和CXCL1表达的相关性。该部分研究获得伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

• 队列3和队列4：包含342例HCC样本（TMA1，队列3）和62例HCC样本（TMA2，队列4）。队列3患者接受根治性切除术的时间为2002年5月至2006年12月，用于生存分析；队列4患者接受根治性切除术的时间为2010年3月至2013年11月，样本用于免疫组化染色。所有患者均签署知情同意书，研究遵循相关伦理标准。

研究设计： 通过RNA测序和遗传筛选确定CRKL作为抗PD-1耐药基因。在小鼠模型中，通过长期药理治疗建立抗PD-1单克隆抗体治疗的耐药模型，并收集耐药肿瘤组织进行RNA分析。研究还纳入了32名接受抗PD-1治疗的不可切除HCC患者，评估治疗效果，并对治疗中的肿瘤组织进行测序 。

统计分析： 使用GraphPadPrism8或R（v.4.0.2）进行统计分析，采用Student’st检验比较两组差异，ANOVA比较多组差异，Kaplan-Meier方法和log-rank检验用于生存分析，Pearson相关性分析用于变量间相关性分析。

研究结果

研究通过对耐药肿瘤组织进行RNA测序和遗传筛选，发现CRKL在抗PD-1耐药肿瘤组织中显著上调。在32名接受抗PD-1治疗的HCC患者中，进一步验证了这一结果，发现CRKL在非应答者中的表达高于应答者，且CD8+T细胞浸润减少（图2），表明CRKL可能是影响抗PD-1治疗效果的关键因素。

图2

为了探讨CRKL在HCC中的预后意义，研究分析了HCC样本中CRKL的表达情况，发现CRKL表达显著升高，且高表达与患者预后不良相关（图3）。进一步分析显示，CRKL高表达与肿瘤大小较大和疾病晚期相关（图4），且是患者术后总生存期和无复发生存期的独立预测因子，这强调了CRKL作为生物标志物在HCC临床治疗中的潜在价值。

图3

图4

另外，研究发现CRKL过表达显著降低了抗PD-1治疗的效果，并抑制了CD8+T细胞的浸润。在免疫健全小鼠模型中，与对照组相比，CRKL过表达组的肿瘤生长未受到抗PD-1单克隆抗体的显著抑制，且肿瘤组织中CD8+T细胞的数量和活性均显著减少，揭示了CRKL在塑造免疫抑制肿瘤微环境中的作用。

进一步的机制研究发现，CRKL过表达通过招募肿TANs改变了肿瘤免疫景观。在CRKL过表达的小鼠模型中，肿瘤浸润性中性粒细胞数量显著增加，而CD8+T细胞数量减少（图5）。特别是PD-L1+TANs在CRKL过表达肿瘤组织中显著上调，这些TANs通过表达PD-L1抑制T细胞活性，从而促进肿瘤免疫逃逸。

图5

研究还提示，VEGFα和CXCL1是CRKL诱导TANs浸润的关键因子。CRKL过表达的HCC细胞通过上调VEGFα和CXCL1的表达，促进了TANs的迁移和激活。使用VEGFα抑制剂贝伐珠单抗和CXCR2/1抑制剂SX-517可有效阻断CRKL过表达诱导的TANs迁移，表明VEGFα和CXCL1在CRKL诱导的TANs浸润中发挥着至关重要的作用。

总之，这一研究揭示了CRKL通过与β-catenin直接相互作用来调控VEGFα和CXCL1的表达。CRKL过表达增强了β-catenin的蛋白水平和活性，而CRKL敲除则降低了β-catenin的蛋白水平和活性。这种相互作用抑制了APC介导的β-catenin泛素化降解，从而促进了VEGFα和CXCL1的表达，为CRKL在HCC中促进肿瘤进展和免疫逃逸的分子机制提供了新的思路。

研究结论和意义

该研究揭示了CRKL在HCC中对抗PD-1治疗耐药性中的关键作用，阐明了CRKL通过β-catenin/VEGFα和CXCL1信号通路调控TANs浸润，导致免疫抑制肿瘤微环境和抗PD-1耐药性的机制。研究结果支持贝伐珠单抗为基础的免疫检查点抑制剂联合治疗策略，并提示CRKL抑制剂联合抗PD-1治疗可能成为HCC治疗的新选择。

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参考文献：

[1]Xie P, Yu M, Zhang B, et al. CRKL dictates anti-PD-1 resistance by mediating tumor-associated neutrophil infiltration in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2024 Jul;81(1):93-107.

审批号：CN-160460 有效期至：2026-05-21

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