固载化酶催化合成多肽的研究进展

摘要：评述了溶剂、载体性质与固载化方法、p H值、底物浓度以及反应温度等因素对固载化酶催化合成肽反应的影响 , 并概括了固载化酶催化合成生物活性肽、寡肽等方面的研究与应用 .

关键词： 固载化酶 酶催化反应 肽 亲水性 疏水性

自1937年Bergmann与Conrat首次报道木瓜蛋白酶与α-胰凝乳蛋白酶催化合成肽以来, 蛋白酶催化合成肽的研究取得了许多成果. 酶法合成肽与化学法相比有许多优点, 如反应条件温和、 消旋率小、 氨基酸侧链常可不必保护和立体专一性强等 [1～6] . 在有机溶剂中酶可催化合成含非蛋白氨基酸的肽, 而基因重组方法却无法实现 [7] . 但是, 自由酶催化合成肽时存在酶不能回收、 成本高、 不稳定、 易变性, 酶浓度高时会出现自溶现象和不易分离等缺点 [8] . 固载化酶不仅可以回收再用, 而且可提高酶的稳定性, 并简化分离提纯工艺, 可适合于多酶反应体系 [4, 8] . 固载化酶是指用物理或化学方法使酶不易随水流失, 即运动受到限制, 并能发挥催化作用的酶制剂. 固载化酶主要有吸附、 包埋、 交联和共价结合等方法 [9] . 固载化酶催化合成肽具有良好的发展前景, 特别是在工业应用上具有自由酶不可比拟的优越性. 因此固载化酶催化合成多肽的研究与应用引起了科学家们的重视. 目前, 酶法合成多肽比较有效的方法是采取热力学控制的肽键形成, 即平衡合成; 或者采取动力学控制的肽键生成, 即非平衡合成. 热力学控制的肽键生成, 反应速度慢, 关键在于通过控制某些影响化学平衡的因素, 如有机辅助溶剂、 反应温度以及不溶性产物生成等, 使平衡向生成肽键方向移动. 对于动力学控制的肽键生成, 首先是N-保护的氨基酸酯与酶快速反应形成活泼的酰基化酶中间体, 然后此中间体迅速与亲核试剂如氨基酸酰胺或氨基酸酯进行转酯化反应生成肽. 水解反应是合成肽的竞争性副反应. 水解反应的强弱直接影响肽合成产率. 本文着重对固载化酶催化合成多肽的影响因素及其应用进行评述.

1 固载化酶催化合成多肽的影响因素

1.1 溶 剂

溶剂能以不同方式影响酶的催化反应. 它既可影响体系中水的分布, 从而影响酶的催化活性; 也可能影响底物与产物的分配, 或作为抑制剂直接影响酶的活性 [10] . 因此, 溶剂体系的选择对固载化酶催化合成多肽十分重要. 文献报道的固载化酶催化合成肽所用溶剂体系主要有3类, 分类如下.

1.1.1 水相体系

产物以沉淀形式析出, 促使平衡向肽键形成方向移动, 这是水相中酶促合成多肽的基础. 固载化酶在水相中催化合成多肽存在许多不足之处, 如水解副反应竞争强烈; 酶用量相对较多; 产物易覆盖在固载化酶周围, 造成扩散限制, 因此在工业上应用受到限制. Haensler等 [11] 报道水解副反应可以通过冷冻反应体系得到抑制. 冷冻使反应液中部分液相变为固相, 液相减少, 反应物浓缩, 促使平衡向合成肽方向移动. 即使氨基组分不是一个有效的亲核试剂, 经过冷冻反应也可得到较高的偶联产率. 以Mal-Phe-OMe为酰基供体, H-Ala-Ala-OH为亲核试剂, 壳聚糖共价固载化α-胰凝乳蛋白酶在25 ℃以及-10 ℃催化合成N-保护三肽Mal-Phe-Ala-Ala-OH, 产率分别为2%, 93%. 在水相中加入易溶的盐 (如硫酸铵) 或其它水-有序试剂 (water-ordering agents) (如聚醇, 糖等) 也可以降低水解活性, 氨解反应与水解反应的速率比显著增加, 从而提高产率 [12, 13] . 在含有1 mol/L的硫酸铵的硼酸缓冲溶液中, 用凝胶多点共价固载化胰蛋白酶催化Bz-Arg-OEt和Leu-NH2合成N-保护二肽酰胺Bz-Arg-Leu-NH4, 产率接近100%. 若不加硫酸铵, 产率约为82% [12] . 此外, 在水中加入两种合适的水溶性高分子, 由于不同高分子的单体间存在排斥力而出现相-相分离, 从而形成双相体系. 利用产物在两相中的溶解度不同, 通过扩散, 也可促使平衡向肽键形成的方向移动. Kitano [14] 报道了共价结合在葡聚糖上的嗜热杆菌蛋白酶在高分子水溶液两相体系 (葡聚糖/水-聚乙二醇/水) 中催化合成甜味肽前体Boc-Asp-Phe-OMe的研究, 由于固载化酶主要分布在葡聚糖水相中, 而产物在聚乙二醇水相中的溶解度相对较大, 通过产物扩散, 平衡向肽键形成方向移动, 但产率较低 (40%) .

1.1.2 水-有机混合溶剂体系

在水中加入有机溶剂, 可增加疏水性底物和产物的溶解度, 而且还可抑制水解反应, 促使平衡向肽键形成方向移动, 从而使肽合成反应更有效地进行 [10] . 水-有机混合溶剂体系分两类: 水-与水互溶的有机共溶剂体系和水-与水不互溶的有机混合溶剂体系. 前者中有机溶剂有较强的亲水性, 如DMF、 乙腈、 THF、 丙酮、 甲醇和丁二醇等. 一般情况下, 肽收率在一定范围内随有机溶剂浓度的增加而增加. Wilson [15] 研究了DMF浓度对固载化Thermus strain Rt41A 蛋白酶催化合成Bz-Ala-Tyr-NH₂的影响. 但发现肽的合成产率并不完全随DMF浓度的增加而增加. 当DMF的浓度从10%增加到40%时, 肽的产率随之降低. 随后肽的产率出现一个相对平稳的阶段. 当DMF的浓度增加到75%时, 肽的收率才开始增加. 分配常数P₀的变化规律与之相反 (P₀是影响水解与氨解速率常数的重要参数,P₀=Kₕ (H₂O) /Kₛ, Kₕ为水解速率常数, Kₛ为氨解速率常数, P₀值愈大, 水解反应愈强烈) . 这表明只有当DMF的浓度达到一定程度时, 水解反应才受到抑制, 促使平衡向肽键形成的方向移动. 乙腈也有类似结果. Lozano等 [16] 报道与水互溶的非质子溶剂对硅藻土吸附固载化α-胰凝乳蛋白酶催化合成具有止痛活性的京都肽衍生物Bz-Tyr-Arg-OEt的影响. 结果发现, 在不同的水-与水互溶的有机共溶剂体系中, 有机溶剂的亲水性愈强, 其最佳浓度愈大, 酶的催化活性愈高. 在所选用的5种与水互溶的非质子溶剂中, THF的疏水性相对较强, 最适有机溶剂浓度最小 (1.2 mol/L) , 酶的最大活性最小 (2.2 U/g 载体) ; DMSO亲水性最强, 最适有机溶剂浓度最大 (5.7 mol/L) , 此时酶的活性最高 (10.8 U/g 载体) . 在水-与水不互溶的有机混合溶剂体系中有机溶剂属疏水性溶剂, 如环己烷、 二氯甲烷等. 由于疏水性有机溶剂与水不互溶而形成双相体系, 通过产物向有机相扩散, 促使平衡向肽键形成方向移动. 相对而言, 与水共溶的有机溶剂体系更易使酶失活. 酶在与水共溶的有机溶剂体系中与有机溶剂接触面积大, 在双相体系中与有机溶剂接触面积小, 故酶在水-有机溶剂双相体系中较稳定. 但是双相体系在塔式操作中会出现沟流, 在工业应用上有一定难度 [17] .

1.1.3 有机溶剂体系

在有机溶剂中 [1, 5, 10] , 酶分子周围需要很少量的水, 借以维持酶具有催化活性的必须构象, 这部分水称作“必须水”. 有机溶剂中含水量较少, 水解副反应大大受到抑制, 因此有机溶剂有利于肽合成反应. 有机溶剂的亲水性强弱直接影响酶的活性. 相对而言, 亲水性有机溶剂容易剥夺酶分子表面的必须水, 从而使酶失活, 疏水性溶剂的效果较好. 溶剂疏水性强弱可用参数lgP来表征. P表示一种有机溶剂在正辛醇-水两相溶液中的分配系数. 在一般情况下, lgP愈大, 疏水性愈强. lgP>4时, 反应介质有利于酶活性的提高, 是较理想的反应介质. lgP<2时, 有机溶剂极性太大易剥夺酶分子表面的必须水, 不宜于作酶促反应的介质. 2

最新研究结果表明, 有机溶剂体系也可以使用混合有机溶剂体系, 如乙腈与N, N-二甲基甲酰胺体系等 [18] . Levitsky 等 [19] 用3种不同载体 (硅藻土、 聚丙烯、 聚酰胺PA6) 分别吸附固载化糖基化 (glycated) α-胰凝乳蛋白酶在乙醇和与水不混溶的有机溶剂组成的混合有机溶剂体系 (乙酸乙酯、 叔丁醇、 氯仿、 甲苯、 正己烷和正癸烷) 中 (含水量3%) 催化合成N-保护的京都肽Z-Tyr-Arg-NH2, 结果发现, 在乙醇中加入疏水有机溶剂, 酶催化活性明显提高, 其中以正己烷效果最好.

1.2 载体与固载化方法

固载化酶的载体应具有一定的亲水性. 疏水性载体因缺少必须水而使固载化酶失活. 但是, 载体的亲水性太强, 效果也不理想. 在低水含量有机溶剂中, 酶的必须水易被亲水性强的载体剥夺, 使酶的活性降低. 在含水量较多的溶剂中, 亲水性强的载体可能会使酶分子活性中心完全被水包围, 酰化酶中间体易发生水解反应. ZHANG [20] 等报道, 4种载体 (硅藻土、 CM-纤维素、 QAE-葡聚糖凝胶A-25和自制的鸡卵清蛋白) 用不同方法固载化木瓜蛋白酶在乙酸乙酯中催化合成N-保护二肽Boc-Phe-Val-OMe, 亲水性低的载体鸡卵清蛋白以及硅藻土的收率较好. 文献[11]报道, 4种载体 (硅胶, Enzacryl AA, 壳聚糖, CM-纤维素) 共价固载化α-胰凝乳蛋白酶在冷冻水溶液中催化合成N-保护二肽Mal-Phe-AA-NH₂ (AA=Ala, Leu, Lys等) , 收率最低的是亲水性强的载体Enzacryl AA. 载体孔径与颗粒大小也可能对固载化酶催化反应产生影响. 控孔玻璃以及硅藻土共价固载化α-胰凝乳蛋白酶在循环反应器中催化合成N-保护的京都肽Z-Tyr-Arg-NH₂, 孔径小的载体有较大的P₀值, 亦即水解反应速率较快, 产率较低; 而孔径大的恰好相反 [21] . 孔径小和颗粒较大的载体易产生较强的传质限制 (mass transfer limitation) , 对酰基供体、 亲核体选择性以及立体选择性都会产生一定的影响 [22] . 然而, XING等 [23] 报道了5种分子筛 (HY, NH₄Y, NaY, HDDY, HNH₄DAY) 吸附α-胰凝乳蛋白酶在有机溶剂中催化合成Z-TyrGlyGlyOEt的研究, 结果表明, Y型微孔分子筛比DAY型中孔分子筛的催化效果好, HY型分子筛固载化酶催化反应的收率最高 (78%) . 其主要原因可能是由于Y型分子筛带有更多的负电荷以及OH官能团, 分子筛与酶之间的氢键作用较强, 使吸附于载体上的酶更稳定. 此外, 固载化酶的催化活性还受载体的酸碱性强弱的影响. XING等 [4] 利用4种分子筛 (HY, NH₄Y, NaY, HNH₄DAY) 吸附固载化嗜热杆菌蛋白酶催化合成甜味肽前体Z-AspPheOMe, 结果与固载化α-胰凝乳蛋白酶不同. 在4种不同类型的分子筛中, HY型分子筛固载化酶催化效果最差, 产率低于10%, 其它的收率在60%～70%之间. 其原因是HY型分子筛有较强的酸性, 使反应液的pH值大大降低 (pH=3.32) (缓冲溶液的pH=6.98) , 超过嗜热杆菌蛋白酶稳定的pH值范围 (pH=6.0～9.0) , 从而导致固载化酶失活, 致使反应收率较低 [23] . 物理吸附固载化酶的活性损失较小,方法简单, 易再生. 缺点是酶与载体结合不牢, 酶易从载体上脱落. 实验中多采用吸附与其它方法相结合, 如吸附包埋、 吸附交联. 酶在有机溶剂中不溶解, 因此吸附固载化酶在有机溶剂中进行催化反应比较有利 [17, 24] . 共价结合固载化酶比较牢固, 尤其是通过多点共价结合在高度活化载体上的酶的稳定性更强, 适合于工业应用上比较激烈的反应条件 [12] , 但在酶与载体进行共价结合的过程中, 酶活性损失较大. 共价结合固载化酶的载体有时需活化, 引入手臂, 避免由于载体的空间阻碍而造成底物分子难以与酶活性部位结合 [25] .

1.3 pH值

酶催化反应的最适pH值除与酶本身有关外, 还受亲核底物的pK值、 缓冲液的离子强度和载体的带电性质等因素影响. 在动力学控制肽合成中, 亲核体进攻酰化酶中间体一般不带电荷. 当溶液的pH值高于底物的pKᵦ时, 亲核底物的去质子化程度随pH值的增加而增加. 非质子化的亲核体浓度增加, 促使平衡向肽键形成方向移动, 并可得到较好的收率. 当pH值高于亲核体pKʙ两个单位时, 亲核体会有98%去质子化. 然而pH值过高 (超过最佳值) , 产率可能由于[OH-]浓度增加而导致水解副反应的发生, 从而使产率降低 [15] . 在热力学控制肽合成中, 最佳pH值相对较低. 这是因为当pH值增加时, 一方面, 亲核体的非质子化形式的浓度增加; 另一方面, 当pH值达到某一个值时, 羧基组分的离子化程度会随pH值的增加而增加. 两者相互平衡的结果, 最佳pH值不可能太高 [12] . 然而, 上面仅为一般情况. Bemquerer等 [26] 利用固载化胃蛋白酶在乙酸乙酯中催化Z-Gly-Phe-OH与PheOMe·HCl合成Z-Gly-Phe-Phe-OMe, 当加入等物质的量的有机碱DIEA中和氨基组分时, 尽管非质子化形式的亲核体浓度增加, 反应速率和产率均明显降低, 但在乙腈中此现象不明显. 其原因是乙酸乙酯 (含水量2%) 为疏水溶剂, 中和后的氨基组分被萃取到有机相, 酶活性部位及其周围的亲核组分的浓度大大降低, 致使反应速率和产率降低. 而乙腈 (含水量4%) 有较强的亲水性, 碱的加入对氨基组分在有机相中的分配影响不大, 因而反应速率和产率基本上不受影响. Barros等 [27] 进行了硅藻土与聚酰胺吸附固载化α-胰凝乳蛋白酶催化AcPheOEt与AlaNH₂·HCl合成N-保护二肽酰胺AcPheAlaNH₂的研究. 结果发现, 当加入30 mmol亲核试剂AlaNH₂·HCl以及15～20 mmol Et3N时, 硅藻土固载化酶催化合成肽的活性明显提高; 当加入Et₃N (30 mmol) 时, 硅藻土固载化酶的催化活性反而降低. 而聚酰胺固载化酶不存在此现象. 其原因是硅藻土的孔径相对较小, 吸附固载化酶的量较多时, 易发生传质限制. 当加入Et₃N的量为15～20 mmol时, 未被中和的质子化亲核试剂将以分离的浓液相形式存在, 并与固载化酶紧密接触. 分离的浓液相有较强的极性, 可以使部分酶从载体上脱落下来, 进入分离的浓液相中, 从而降低传质限制. 另一方面, 分离的浓液相中亲核试剂浓度较高, 有利于亲核专一性的提高, 所以在此条件下硅藻土固载化酶催化合成肽的活性明显增加, 而聚酰胺的孔径较大, 不易发生物质扩散限制, 所以不存在此现象. Noritomi等 [24] 利用聚乙烯醇 (PVA) 固载化的α-胰凝乳蛋白酶在含少量水的乙腈中催化合成肽 (Ac-Tyr-Gly-NH₂) , 发现pH值对反应几乎无影响 (pH值范围5～10) . 这可能是磷酸缓冲液对亲核体产生影响的结果, 因为无缓冲液时pH值对反应影响比较大. 另外带有电荷的载体也会影响最适pH值 [20, 23] . 阳离子交换树脂会导致最适pH值偏低, 阴离子交换树脂相反 [15] .

1.4 底物浓度

增加底物的浓度, 可以提高产率, 有时甚至可以达到定量转化. 定量转化可简化分离提纯的步骤. 然而并非所有情况都如此. 在热力学控制肽合成时, 酰基供体的羧基为游离态, 过量加入可能导致pH值发生变化, 影响产率. 当底物的溶解性不好时, 过量加入会引起底物扩散限制 [28] . 高浓度底物还会使酶失活加快. Cramer等 [29] 利用固载化羧肽酶Y在批式搅拌反应器中催化合成肽Bz-Arg-Met-NH₂, 当Bz-Arg-OEt的浓度为10 mmol/L, 亲核体Met-NH₂的浓度分别为50, 200 mmol/L时, 固载化羧肽酶Y在反应10 h后的活性分别为原来的98%, 85%; 当亲核体Met-NH2的浓度为50 mmol/L, Bz-Arg-OEt的浓度分别为10, 50 mmol/L时,固载化羧肽酶Y在反应10 h后的活性分别为原来的98%, 80%. 此外, 当酰基组分浓度达到饱和时, 增加其浓度对产率无影响 [12] .

1.5 温 度

提高反应温度通常会增加酶催化反应的速度, 但温度过高会引起酶的变性失活, 反而降低肽产物的收率. 一些研究报道表明, 在低温下酶促肽键生成有较好的收率. Nillson等 [4] 利用琼脂固载化的α-胰凝乳蛋白酶在50%DMF溶液中催化合成肽Ac-Phe-Gly-NH₂, 在22 ℃和-10 ℃时肽收率分别为67%, 86%. Blanco等 [13] 利用固载化胰蛋白酶 (Trypsin) 催化合成Bz-Arg-LeuNH₂, 在4 ℃与37 ℃分别得到40%, 20%的产率. 可能由于亮酰胺吸附在胰蛋白酶的活性中心是一个疏水过程. 尽管温度升高, 有利于疏水相互作用, 然而疏水相互作用在疏水吸附过程中是次要的因素, 主要影响因素是溶解在水中的亮酰胺的疏水部分以及被水包围的胰蛋白酶的疏水亚基 (hydrophobic subsite) 溶剂化能的变化. 因为温度升高有利于疏水化合物溶剂化, 整个疏水吸附过程在热力学上是一个放热过程, 所以温度升高并不能增加反应产率.

此外, 酰基供体的结构以及保护基对固载化酶合成多肽也有影响. 硅藻土吸附固载化胃蛋白酶催化Z-AA-Phe-OH (AA=Ala, Asp, Glu, Gly, Phe, Ile, Val, Trp, Tyr) 与Phe-OMe形成相应的肽, 反应速率表明P₂位置含有亲水性取代基的羧基组分的反应速率较快, 与水相中的结果相反. 其原因是有机溶剂中疏水作用是次要的, 极性强的羧基组分在酶周围水相中或活性部位的分配浓度较高 [26] . 固载化Aspergillus oryzae protease催化Boc-L-Tyr, Cbz-L-Tyr与Gly-NH₂合成相应的N-保护二肽酰胺, 其产率分别为57.12%, 0.98% [7] , 在此反应中, 显然保护基Boc比Cbz效果好.

2 固载化酶在肽合成中的应用

用自由酶催化合成多肽的酶均可以进行固载化并用于肽合成. 如嗜热杆菌蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 α-胰凝乳蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶、 胃蛋白酶、 羧肽酶Y等. 所合成的肽包括低热值高甜度的甜味剂、 具有镇痛作用的脑啡肽、 具有止痛作用的京都肽及其它生物活性肽等.

固载化嗜热杆菌蛋白酶催化合成肽主要是甜味肽前体 (N-Z-L-Asp-L-Phe-OMe) 的合成, 收率较高. 例如, Oyama等 [30] 用载体Toyopearl共价固载化此酶在乙酸乙酯/水两相体系中定量催化合成该前体, 并研究了不同手臂对固载化酶活性的影响; Nagayasu等 [31, 32] 用XAD-7吸附交联固载化嗜热杆菌蛋白酶在多种有机溶剂中进行了合成该前体的研究. 结果表明, 在含少量水的叔戊醇中固载化酶比在乙酸乙酯中有更好的反应活性与稳定性. 卓仁禧 [28] 和吴梧桐等 [33] 分别用多孔硅球、 海藻酸钠固载化此酶在水相中也催化合成了该前体. 此外, Basso等 [34] 利用硅藻土 R-640 在甲苯中吸附制备固载化嗜热杆菌蛋白酶, 以热力学控制方法在甲苯中催化合成N-保护二肽Z-Phe-XX-P (XX-P: PheOEt, TyrOEt, LeuNH₂) , 即使用等物质的量浓度进行反应, 也几乎达到定量转化. 这是由于反应过程中生成的水不断的被载体硅藻土R-640吸收, 使反应体系保持足够低的水活度 (a ᴡ) , 水解反应受到抑制, 从而得到很高的收率. Amberlite XAD-7吸附交联此酶在水-乙酸乙酯两相体系以及乙酸乙酯单相中催化合成了N-Z-Phe-Phe-OMe (95%) . 经估算, 在两相中、 30 ℃条件下, 此固载化酶在批式反应器中可重复操作1 100 h, 而活性仅丧失一半 [8] . WANG等 [35] 利用硅藻土吸附固载化木瓜蛋白酶, 在含少量水的乙酸乙酯中催化合成了亮-脑啡肽的前体N-保护二肽的酯Boc-Phe-Leu-OMe (90%) . ZHANG等 [20] 利用鸡卵清蛋白共价固载化木瓜蛋白酶在乙酸乙酯中合成了亮-脑啡肽的前体N-保护三肽的酯Cbz-Tyr-Gly-Gly-OEt. Fite等 [36] 使用硅藻土与聚丙烯酰胺吸附固载化此酶催化合成了八肽胆囊素 (Cholecystokinin) 中的保护二肽片段: P-Gly-Trp-OBzl (P=PhAc and Mand) . 此外, 交联的聚苯乙烯共价固载化木瓜蛋白酶在二氯甲烷与水的混合溶剂中催化合成了Boc-Val-Gly-OEt, Boc-Ala-Phe-OMe等肽酯, 产率中等 [24] . Enzacryl AA-Papain在磷酸盐缓冲溶液 (含NaCl与EDTA) 中催化合成了Z-Arg-Ala-NH₂ [37] .

磺酸化作用可以增加生物分子的生物活性, 也能改变一些肽与小蛋白的折叠结构. 化学法引入磺酸官能团不具有选择性, 伴随较多副反应. Delhom等 [38] 利用琼脂凝胶多点固载化芳基磺酸转移酶 (Arylsulfotransferase) 选择性地将对硝基苯酚磺酸的磺酸官能团转移到含酪氨酸的生物活性肽的酪氨酸残基上. 如LH-RH, Z-亮脑啡肽经固载化酶催化磺酸化后, 分别得到相应的产物: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr (SO₃H) -Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (98%) , Z-Tyr (SO₃H) -Gly-Gly-Phe-Leu-OEt (95%) .

固载化α-胰凝乳蛋白酶在肽合成中的应用报道较多. 在亲水有机溶剂中, α-胰凝乳蛋白酶催化合成N-保护二肽酰胺Ac-Tyr-Gly-NH₂, 聚乙烯醇吸附固载化α-胰凝乳酶的催化产率比未固载化时大大增加 [24, 39] . 在50%DMF中, 高度活化琼脂固载化此酶催化合成了Ac-Phe-Ala-NH₂ (97%) [4] . 在55%～60%的DMF中, 琼脂固载化此酶催化合成了N-AcO-Phe-Leu-NH₂, m-Cl-N-Bz-Phe-Leu-NH₂, 但未得到o-Cl, p-Cl相应的产物. 其原因可能是此固载化酶的疏水口袋易与带有负电荷的m-Cl酰基给体结合 [40] . Afrin 等 [41] 利用特氟隆 (polytetrafluoro-ethylene) 包埋固载化α-胰凝乳蛋白酶催化合成了Ac-Phe-Ala-NH₂, 但由于特氟隆是疏水性载体, 产率较低.

用固载化酶Enzacryl AA-Trypsin催化合成了Z-Lys-Leu-NH₂, 产率中等. 纤维素固载化胰蛋白酶催化Bz-Gly-Lys-OH 与HCl·Leu-OMe合成了Bz-Gly-Lys-Leu-OMe (93%) , 而且还催化猪胰岛素去丙氨酸B链 (30B-deAla) 与苏氨酸叔丁酯合成了人胰岛素叔丁酯 (70%) [37] .

Bacheva等 [18] 利用PVA-cryogel 固载化枯草杆菌蛋白酶在不同比例的乙腈与N, N-二甲基甲酰胺混合溶剂中催化Z-Ala-Ala-LeuOCH₃和Phe-pNA合成了四肽衍生物Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA, 并发现Z-Ala-Ala-LeuOH, Z-Ala-Ala-LysOH和Z-Ala-Ala-GluOH等也是此固载化酶的合适底物. 热力学与动力学控制方法合成肽的收率差别不大 (约85%) , 并已用于规模化生产.

化学修饰可使固载化酶的专一性发生改变. 固载化嗜热杆菌蛋白酶的Tyr110经Ac-Phe-OSu酰化后, 催化链短的酰基底物合成肽或所生成的肽水解的活性增加. 与酰化前相比, 其催化合成与水解二肽Fua-Gly-Leu-NH₂和Fua-Gly-Phe-NH₂ (Fua=N- ([3- (2-furyl) acryloyl]amino acid) 的活性均增加约3倍, 但对合成二肽Fua-Phe-Leu-NH₂和Fua-Phe-Phe-NH₂的活性未发生改变, 水解活性明显降低. 由此可见, 经酰化后, 酶的专一性变宽 [42] . 从酵母菌中制得的羧肽酶Y具有较宽的专一性. 在酸性条件下具有外切肽酶的活性, 而在碱性条件下又是一个有效的酯酶. 固载化羧肽酶Y可用于脱除肽C-端的α-酯官能团, 而侧链的羧基 (如谷氨酸、 天门冬氨酸) 以及C端D-型氨基酸的α-羧基所形成的酯却不受影响 [43] . 固载化羧肽酶Y在S'₁ (Met⁻³⁹⁸) 位经苯甲酰溴修饰后, 有较强的酰化酶活性, 可用于肽C端的酰胺去酰化, 且比较稳定. 在脱除肽C-端的α酯基或去酰化的条件下, 它们所表现出来的肽酶活性可以忽略不计. 固载化羧肽酶Y若用汞化物 (PhHgCl) 修饰, 催化肽合成的选择性增强, 但不稳定. 固载化羧肽酶Y以及PhHgCl修饰后的固载化羧肽酶Y催化Bz-Ala-OMe与Val-OMe合成Bz-Ala-Val-OMe, 结果是前者有较多的副产物Bz-Ala和Bz-Ala-Val. 而后者几乎没有副产物Bz-Ala-Val. 固载化羧肽酶Y经苯甲酰溴或汞化物 (PhHgCl) 修饰, 选择性增强, 其原因是在S'₁引入苯基, 导致S'₁位有较大的立体位阻 [44] . 经化学修饰的固载化酶更适合于催化合成某些肽的反应. 合成肽的亲核组分可以是氨基酸、 氨基酸烷基酯或氨基酸酰胺, 氨基酸亲核效果不好, 产率较低. 氨基酸烷基酯作为亲核体, 固载化羧肽酶Y催化反应时易发生寡聚生成寡聚氨基酸, 不易控制. 氨基酸酰胺不会出现寡聚, 且收率较好 (60%～95%) . Cramer等 [44, 29] 利用汞化物修饰的固载化羧肽酶Y的肽酶活性及苯甲酰溴酰化的固载化羧肽酶Y的酰化酶活性, 以氨基酸酰胺为亲核体, 经过多次肽偶联-肽酰胺的去酰化-羧基甲酯化, 逐步合成了N-Bz-Arg-Met-NH₂, N-Bz-Arg-Met-Leu-NH₂及N-Bz-Arg-Met-Leu-Phe-NH₂. 最后一个产物是合成N-保护三肽N-Formyl-Met-Leu-Phe的中间体.

此外, 部分固载化酶已用于反应器中催化合成肽. 固载化嗜热杆菌蛋白酶、 木瓜酶以及α-胰凝乳蛋白酶在乙酸乙酯中合成了一些含必须氨基酸的肽, 如Z-Lys (Z) -Ile-OMe, Z-Leu-Phe-OMe和Boc-His (Tos) -Val-OEt等, 产率较高 [45] . 固载化嗜热杆菌蛋白酶、 α-胰凝乳蛋白酶在乙酸乙酯中通过连续缩合与转酯反应催化Z-Gly, PheOMe与LeuNH₂合成了三肽Z-Gly-Phe-LeuNH₂. 在塞流式反应器中连续操作220 h, 产率在80%以上, 而固载化嗜热杆菌蛋白酶、 α-胰凝乳蛋白酶的活性基本保持不变, 分别为原来的94%, 100% [46] .

3 结 语

固载化酶催化合成多肽的研究方兴未艾. 其发展历史相对较短, 机遇与挑战并存. 预计今后的研究主要有3个方面: (1) 遴选与开发合适的、 新的载体. 用于固载化酶的载体需具有一定的亲水性与机械强度, 使固载化酶保持较高的活性, 可多次重复使用. 固载化酶重复使用的次数多少对其在工业上的应用有重要的影响. 此外, 还需考虑载体来源及价格等因素. (2) 固载化酶方法的研究. 固载化酶的方法较多, 如吸附、 交联、 共价偶联等. 从已有的报道来看, 共价固载化酶催化合成肽的研究相对较少, 尚待发展, 主要是由于共价固载化酶活性损失较大所致. 然而, 共价固载化酶有其自身的优点: 酶与载体结合牢固, 可多次重复使用, 而酶一般不会从载体上脱落下来. 若能选用合适的偶联试剂与载体, 使共价固载化酶有较高的固载化效率及催化活性, 则其应用, 尤其是工业上的应用前景广泛. (3) 筛选新菌种, 挑选新的酶源, 增加固载化酶的数量, 拓宽固载化酶催化合成肽反应的范围.

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