Cell Metabolism丨刘丹倩团队：大脑过氧化氢信号调控睡眠稳态的机制解析

熬夜等睡眠缺乏后，机体通常会延长补偿性睡眠以恢复受损的生理功能，这一过程被称为睡眠稳态调控。其核心驱动力，即睡眠压力，在持续觉醒中不断积累，并在随后的睡眠中释放【1】。尽管这一概念已被广泛接受，且长期有观点推测大脑中存在与之对应的生化信号，但其具体的分子机制仍未明确。早在1994年，E. Reimund就提出了“睡眠的自由基理论”（The free radical flux theory of sleep），认为觉醒期间大脑代谢活跃，可能伴随产生大量自由基，其可能是驱动睡眠的信号之一【2】。近年来，果蝇研究初步支持了这一假设：睡眠剥夺可增加大脑中线粒体活性氧（ROS）【3】，并提出氧化脂质可作为信号分子激活睡眠神经元，启动睡眠稳态响应【4】。然而，在哺乳动物中，睡眠剥夺是否导致脑内ROS升高仍存在争议【5】，其在睡眠调控中的作用机制更缺乏直接证据。研究的难点在于氧化还原信号高度复杂，且缺乏可用于活体大脑的高时空ROS监测技术。

2025年5月15日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心的刘丹倩研究员团队在Cell Metabolism上发表了题为Hydrogen peroxide in midbrain sleep neurons regulates sleep homeostasis的研究论文。该研究通过构建活体ROS信号研究体系，首次实现了对动物脑内过氧化氢（H₂O₂）动态变化的实时监测与精准调控。研究发现，小鼠中脑睡眠神经元内的H₂O₂水平可表征睡眠压力的强度，并揭示其作为分子信号调控睡眠稳态的因果作用与机制。该成果不仅为理解哺乳动物睡眠稳态的分子与神经基础提供了关键证据，也提示氧化还原稳态可能是跨物种保守的睡眠调控机制。

研究人员首先通过腹腔注射可穿越血脑屏障的ROS荧光染料二氢乙锭（DHE），在睡眠剥夺期间标记并原位检测全脑ROS水平。结果发现，睡眠剥夺6小时可显著升高多个脑区的ROS，尤其在已知的睡眠调控区域如脑干面旁核（PZ）和中脑黑质网状部（SNr）中最为显著。

为进一步明确ROS变化与睡眠压力的动态关系，研究人员利用遗传编码的H2O2特异性荧光探针roGFP2-Orp1与亚细胞器定位表达系统，构建了具亚细胞特异性的深脑在体荧光光纤成像系统。结果显示，在自发觉醒或睡眠剥夺的强迫觉醒过程中，中脑SNr（而非PZ）的促睡眠神经元胞浆内的H2O2水平随觉醒时间的延长而逐步升高，其动态变化与睡眠压力的累积高度吻合，可准确拟合其指数增长特征。此外，H₂O₂水平还与随后睡眠的深度呈显著正相关。这表明SNr睡眠神经元内的H₂O₂是反映睡眠压力强度的可靠分子标记。

为明确H2O2是否参与睡眠稳态调控，研究人员利用Tet-ON系统在SNr睡眠神经元中特异性诱导表达过氧化氢分解酶Catalase，以下调H₂O₂水平。结果显示，Catalase过表达显著降低小鼠本底的非快速眼动（NREM）睡眠时长，并削弱其对睡眠剥夺的代偿反应，提示SNr睡眠环路的H₂O₂信号在维持睡眠稳态中不可或缺。

在此基础上，研究人员进一步建立基于D-型氨基酸氧化酶（DAAO）的化学遗传学系统，通过脑室注射底物D型丙氨酸（D-ala）诱导DAAO反应产生H2O2。结合实时H2O2成像发现，诱导产生的H₂O₂量与D-ala浓度密切相关。低剂量（≤1 mM）D-ala产生的H₂O₂接近生理水平，具有显著促睡眠作用；而高剂量（10 mM）则诱发脑内局部炎症并导致睡眠结构高度碎片化。此外，通过利用弱光毒性的mCherry蛋白结合激光照射释放ROS的光遗传学技术，验证了黄光照射产生的生理范围内H2O2同样具有促睡眠效应。

值得注意的是，H₂O₂的促睡眠作用具有高度特异性。在SNr中与睡眠调控无关的小清蛋白（PV）阳性神经元，或者在PZ脑区的促睡眠神经元中诱导H₂O₂生成均不改变睡眠结构。此外，在SNr睡眠神经元通过线粒体靶向DAAO生成的H₂O₂也不会促进睡眠，这与成像实验所观察到的线粒体H₂O₂水平不随睡眠压力变化的结果相一致。这些结果表明，大脑特定的促睡眠神经环路能感知并响应H₂O₂信号，且其调控作用依赖于生理浓度范围内的胞浆H₂O₂。

那么H2O2是如何作用于SNr促睡眠神经元，从而实现睡眠稳态调控的？已有研究表明，在小鼠入睡前，该神经元群的放电频率逐步上升以促进睡眠【6】。在此基础上，该研究结合免疫染色和膜片钳记录，发现低剂量H₂O₂可显著激活SNr促睡眠神经元，增强其自发放电频率。分子机制层面，研究发现SNr脑区表达多种可被ROS信号激活的瞬时受体电位（TRP）通道，其中TRPM2的表达最为丰富，其激活可介导阳离子内流，神经元兴奋性增加。为明确其功能作用，研究人员利用RNA干扰技术特异性敲低SNr睡眠神经元中的TRPM2。结果显示，H₂O₂诱导的神经元兴奋性增强及其促睡眠效应均被显著削弱，且小鼠表现出本底睡眠减少以及对睡眠剥夺的稳态补偿反应减弱。综上，TRPM2作为H₂O₂信号的感知器，介导其对SNr促睡眠神经元兴奋性及睡眠稳态的调控作用。

综上，不同于传统将ROS视为细胞毒性因子的观点，本研究揭示了在生理浓度下，H₂O₂作为信号分子被促睡眠神经环路感知，能够将觉醒过程中积累的氧化还原失衡转化为促睡眠信号，驱动睡眠发生以维持大脑的氧化还原稳态。这一发现揭示了大脑氧化还原信号在睡眠稳态调控中的因果作用和新机制，也支持了睡眠的抗氧化功能假说，为应对神经退行性疾病等与氧化应激相关的睡眠障碍提供了新的抗氧化策略。

https://www.cell.com/cell-metabolism/abstract/S1550-4131(25)00254-2

制版人： 十一

参考文献

1.Franks, N.P. and W. Wisden, The inescapable drive to sleep: Overlapping mechanisms of sleep and sedation.

Science

2.Reimund, E., The free radical flux theory of sleep.

Med Hypotheses

3.Kempf, A., et al., A potassium channel beta-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep.

Nature

4.Rorsman, H.O., et al., Sleep pressure accumulates in a voltage-gated lipid peroxidation memory.

Nature

5.Vaccaro, A., et al., Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut.

Cell

6.Liu, D., et al., A common hub for sleep and motor control in the substantia nigra.

Science

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