暨南大学发掘青蒿酸生物合成二氢青蒿酸关键酶

2006 年，D. K. Ro 等人首次实现工程化酵母菌株发酵生产青蒿酸（Artemisinic acid, AA）——抗疟疾药物青蒿素（Artemisinin, ART）的前体化合物，开启了采用合成生物学方法生产青蒿素类化合物（Artemisinins, ARTs）的新篇章。

2013 年，C. J. Paddon 等人通过对 ART 生物合成进行工程化改造和定向整合，实现高产量 AA 的生产（25 g/L，5 L 发酵罐）。随后他们通过 AA 化学合成二氢青蒿酸（Dihydroartemisinic acid, DHAA），再经 DHAA 自动氧化实现半合成法生产 ART。但化学合成和多步自动氧化步骤仍面临产量损失，成本过高等问题，导致目前 ART 的市场来源仍然主要依赖于直接从黄花蒿植株中提取获得。

在 ART 的生物合成途径中，AA 经 DHAA 转化为 ART 是目前最优的路径（Km (ALDH1 to AO) = 2.58 μM, Km (DBR2 to AO) = 19 μM，代谢流倾向于生成 AA），而催化 AA 生物合成 DHAA 的关键酶一直未被发现（图 1）。

近日，暨南大学中药生物技术研究所朱建华教授和于荣敏教授团队在 Nature Commnications 期刊发表题目为“Dihydroartemisinic acid dehydrogenase-mediated alternative route for artemisinin biosynthesis”的研究成果。朱建华教授的主要研究方向：（1）天然药物活性成分的生物合成；（2）植物外泌体研究。于荣敏教授的主要研究方向：（1）天然药物化学成分的生物合成和生物转化；（2）多肽蛋白/多糖活性成分研究；（3）创新药物研制与开发。

该研究首次报道了一种来自黄花蒿的二氢青蒿酸脱氢酶（Dihydroartemisinic acid dehydrogenase, AaDHAADH），AaDHAADH 能够催化 AA 和 DHAA 之间的双向转化。研究团队通过定点诱变技术获得了该酶的定向优化突变体（活性提高 2.82 倍），实现了 AA 到 DHAA 的高效转化，并且在酿酒酵母中实现了 DHAA 的从头合成，通过补料分批发酵在 5 L 生物反应器中实现了 3.97 g/L 的 DHAA 产量。为 ART 的生物合成提供了一条更加便捷、高效的生产途径。

本研究创新性的采用以活性导向的蛋白纯化、蛋白质组学和生物信息学技术相结合的策略，成功的从复杂的植物粗酶体系中富集到目标酶，为鉴定低丰度酶和阐明未知中间产物的天然产物生物合成途径提供了新思路。

本研究在酶功能验证中不仅建立异源表达体系（大肠杆菌和本氏烟草），还将候选基因在内源宿主（黄花蒿细胞）中进行功能验证, 该方法更接近酶的天然催化环境, 可以真实反映其生理作用, 弥补了异源表达系统的不足。同时, 过表达和 RNAi 干扰实验的结果相互印证, 进一步确证了 AaDHAADH 在催化 AA/DHAA 转化和 ART 生物合成中的关键作用（图 2）。

图 2 | 转基因黄花蒿细胞系中AaDHAADH 的相对表达情况及化合物 AA、DHAA 和 ART 的含量变化

为了实现 DHAA 的发酵生产，作者通过对MVA途径（ERG10、ERG19、IDI1、tHMG1 和 ERG20）和 ART 下游生物合成途径中的关键基因（ADS、CYP71AV1、CPR、ALDH1、ADH1、CYB5 和 AaDHAADH (P26L)）进行定向整合，得到高产 DHAA 的酿酒酵母底盘菌株（菌株 DHAA-2）。菌株 DHAA-2 在 250 mL 摇瓶中的发酵产量为 0.35 g/L，采用 5 L 生物反应器对菌株 DHAA-2 进行分批补料发酵，在 216 h 时DHAA的产量达到 3.97 g/L（图 3）。AaDHAADH 的发现，为半合成法生产 ART 提供了一条更加经济、高效的 DHAA 来源途径。

基于 DHAA 可以自动氧化生成 ART 的特性，作者通过瞬时表达 ART 生物合成途径中的关键基因（tHMG1、ERG20、ADS、CYP71AV1、CPR、CYB5、ADH1、ALDH1和 AaDHAADH (P26L)），在本氏烟草中重构 ART 的生物合成途径（图 4-A）。通过在本氏烟草中共表达 ADS、CYP71AV1 和 CPR，发现 AA 的产量为 0.28 mg/g DW（图 4-B,D）。当引入 ADH1、ALDH1 和 CYB5 后，AA 产量提升至 0.62 mg/g DW（图 4-B,D）。进一步通过添加 MVA 途径的关键基因 tHMG1 和 ERG20 优化瞬时表达系统，成功将 AA 产量提高至 1.19 mg/g DW（图 4-B,D）。加入定向优化的活性酶 AaDHAADH（P26L）后，DHAA 产量达到 0.51 mg/g DW（图 4-C,D），但在瞬时表达的本氏烟草中未检测到 ART。为加速 DHAA 自动氧化生成 ART，作者对本氏烟草叶片进行紫外线照射处理，最终检测到 ART 产量为 0.041 mg/g DW（图 4-C,D）。

利用本氏烟草瞬时表达系统重构 AA/DHAA/ART 生物合成途径，不仅证实了 AaDHAADH 在异源植物体内的催化功能，也为后续工程化植物合成 ART 积累了重要的元件和思路，对探索 ART 转运机制、提高植物合成效率具有重要意义。同时，这一研究也揭示了 DHAA 经自动氧化生成 ART 的化学转化机制，进一步佐证了 DHAA 是 ART 生物合成的直接前体。

本研究在 ART 生物合成中成功鉴定获得活性酶 AaDHAADH, 填补了 AA 生物合成 DHAA 关键酶的空白。同时, 本研究在酿酒酵母中实现了 DHAA 的从头合成, 在 5 L 生物反应器中的产量达到 3.97 g/L, 展现了良好的应用前景。此外, 本研究在本氏烟草中重构了 ART 的生物合成途径, 进一步验证了 AaDHAADH 在植物体内的催化功能, 也为 ART 的工程化植物合成提供了新的元件和思路。

1. Guo, Z., Zhou, Y., Li, J. et al. Dihydroartemisinic acid dehydrogenase-mediated alternative route for artemisinin biosynthesis. Nat Commun 16, 3888 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-59312-1

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