Mol Cell | Jennifer Doudna/Zev Bryant/史弘略团队破解CRISPR基因编辑效率谜题

CRISPR-Cas9被誉为“分子手术刀”，其高效精准的基因编辑能力已在多种生物体系中广泛应用。但一个基础问题至今未解：Cas9为何如此高效，而其“去PAM化”变体（如SpRY）在功能扩展时却遭遇严重效率瓶颈？

2025年4月23，诺贝尔化学奖得主Jennifer Doudna与斯坦福大学Zev Bryant团队合作（北京大学校友、现任伯克利博士后的史弘略博士作为共同第一作者，主导关键生化与动力学实验设计）在Molecular Cell在线发表了文章Rapid two-step target capture ensures efficient CRISPR-Cas9-guided genome editing，以单分子分辨率揭示Cas9识别基因的动态机制。这一工作不仅揭示了Cas9依赖“精准而适度的PAM识别 + 快速DNA解旋”的两步机制，更为“是否该不计代价开发去PAM化编辑器”这一行业争议提供了明确答案。

一、PAM序列：Cas9识别靶标的导航密码

CRISPR-Cas9的工作机制可类比为在一张复杂的基因组地图中精准找到一个地址。Cas9能否定位到目标序列，取决于一个小小的“邮编”——PAM序列（Protospacer Adjacent Motif，通常为NGG）。PAM虽然本身并非目标，但它是Cas9启动搜索的先决条件。

科学界一直试图摆脱这一限制，开发“去PAM化”的Cas9变体，如SpRY，期望实现对全基因组任意位置的编辑。但这些变体普遍面临效率下降和脱靶风险增加的问题。正如史弘略博士所说：“这就像把自动驾驶系统的‘车道线’全部抹去，虽然理论上可以走遍所有地方，但车辆更容易迷失方向。”

二、技术突破：两大利器破解动态谜题

为揭开Cas9效率背后的分子机制，研究团队结合两项核心技术：

1. 单分子转子磁珠追踪（Rotor Bead Tracking, RBT）

由斯坦福博士生Noor Al-Sayyad开发的RBT技术通过在DNA上连接一个60纳米金纳米球，实时记录Cas9蛋白的结合与DNA解旋过程，精度可达单碱基水平。这一“分子摄像机”首次直接观察到Cas9完成靶点识别和R-loop形成的全过程。

2. 多维度生化系统构建

史弘略博士设计并主导了一整套生化实验，包括：

· DNA足迹分析：用化学探针描绘Cas9的初始结合的解旋路径。

· 竞争性结合实验：模拟细胞中海量非靶DNA竞争环境。

· 人工错配干预：引入“解旋气泡”降低能垒，测试Cas9启动效率。

三、“精准两步舞”：野生型Cas9的效率秘诀

RBT数据显示，野生型Cas9之所以高效，在于它的“两步识别机制”中精密的时间管理：

1. 轻触PAM，快进快出

Cas9对PAM的亲和力适中（Kd约为1 μM），就像“扫地雷”一样快速掠过潜在位点，识别不合适即刻离开，避免被非特异性序列“缠住手脚”。

2. 闪电解旋，一击即中

一旦识别到正确的DNA序列，Cas9立即启动R-loop形成，解开DNA双链的时间不到100毫秒——几乎与人类眨眼同步，为后续精准剪切赢得宝贵先机。

而SpRY则展现出灾难性的动力学失衡：

1. 结合太强，位点太多

SpRY虽然能识别更多PAM序列，但“黏性”太强（结合力是野生型Cas9的100倍），而且几乎哪儿都能粘上。这导致它到处“徘徊”，在非目标DNA上反复停留，反而迷失方向，错过真正要剪的靶点。

2. 启动滞后，效率崩溃

即使SpRY成功抵达目标位点，其解旋过程仍严重滞后，常需数十秒才能启动R-loop形成，远远落后于野生型Cas9亚秒级的快速反应，导致整体编辑效率显著下降。

四、生化实验证明

为验证Cas9识别动力学的核心假说，史弘略博士设计并主导了三组环环相扣的实验，逐步剖析SpRY效率低下的深层原因：

1. DNA足迹实验：留下“错误脚印”

在模拟Cas9初始结合状态的体系中：

• 野生型Cas9仅在PAM邻近区域解旋2–3个碱基，精准出手；

• 而SpRY不仅无法有效打开PAM区域，反而在DNA链上随机打开1–2个碱基，动作杂乱、方向迷失。

2. 竞争压力测试：模拟基因组级混战

当系统中加入浓度高达目标DNA 400倍的竞争性DNA，模拟真实细胞中海量非目标片段的干扰环境：

• 野生型Cas9凭借“快进快出”的识别逻辑，剪切速率仅略降约1.3倍；

• SpRY则陷入全面瘫痪，剪切活性暴跌200倍，几乎失去功能。

3. “解旋气泡”策略：突破能量瓶颈

在目标位点旁人工制造错配碱基（即“小气泡”），人为降低DNA解旋的能量壁垒：

• SpRY剪切速率跃升5倍，短暂回归野生型水平；

• 但在复杂环境下，其活性仍远逊于Cas9，差距高达30倍。

“这说明问题的根源不是某个单点瓶颈，而是整个识别—解旋过程的动力学耦合被打乱。”史弘略博士总结道。

五、“万能编辑”是否科学？争议终结

“我们不该盲目追求去PAM化。”Jennifer Doudna在总结中强调，“未来基因编辑工具应构建一个多样化的‘PAM工具箱’，为不同临床或科研需求选择合适的Cas9变体，而非妄图以一个万能工具通吃全场。”

这一观点为长期以来“是否要牺牲效率换取广谱性”的争议画上句号。

六、技术启示：单分子技术开启新篇章

本研究的真正突破，不止在于机制的解析，更在于技术的革命。

传统生化实验只能提供群体平均数据，而RBT实现了对单个酶分子的“动态CT扫描”，能够实时监测结合持续时间、解旋幅度、状态转换速度等关键参数，为判断酶活性与脱靶风险提供了强有力工具。

正如Zev Bryant所说：“冷冻电镜让我们看清结构，单分子技术则让我们看懂动作。当我们真正理解分子的行为逻辑，精准治疗将成为现实。”

史弘略，共同第一作者，北京大学化学与分子工程学院本科，杜克大学化学系博士，现为加州大学伯克利分校博士后，聚焦CRISPR-Cas系统酶动力学与工具优化。Noor Al-Sayyad与Kevin Wasko为共同第一作者，分别来自斯坦福大学生物工程系与加州大学伯克利分校分子生物学系。Jennifer Doudna，2020年诺贝尔化学奖得主，CRISPR-Cas9基因组编辑技术发明人之一；Zev Bryant，斯坦福大学生物工程系教授，单分子生物物理技术开拓者。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.03.024

制版人： 十一

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