生物指示剂最短培养时间怎么测？这项研究给出全新可靠方案

生物指示剂（BIs）作为评估灭菌效果的关键工具，其最短培养时间（MIT）的测定长期面临缺乏国际公认方法的困境。1986年，美国食品药品监督管理局（FDA）虽试图在设备和放射健康中心（CDRH）通过发布《生物指示剂培养时间验证指南》提出了将缩短培养时间（RIT）至七天以下的方法，但由于缺乏实证支持，该方法未能得到广泛应用。为解决这一行业难题，2007年，国际标准化组织/技术委员会198（ISO/TC198）生物指示剂工作组启动技术规范制定计划，明确要求所制定的方法需通过同行评审验证。

在此背景下，美国医疗器械促进协会于2008年成立特设委员会展开专项研究，其发表的两项成果为MIT测定奠定了理论基础。本文将详细阐述基于这些成果提出的创新MIT测定方法。

一、最短培养时间（MIT）测定方法

本研究深入分析了10,000多种暴露于不同灭菌过程的生物指示剂的生长时间，研究范围涵盖多种生物指示剂配置，包括自含式生物指示剂和传统孢子条，孢子载体选用纸和不锈钢材质。同时，选取嗜热土芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌这两种最常用的细菌内孢子作为研究对象。

科德角国际丨BI-O.K.™蒸汽灭菌自含式生物指示剂（左）

BI-O.K.™环氧乙烷自含式灭菌生物指示剂（右）

在实验过程中，严格控制生长培养基，并选择121℃、132℃、134℃和135℃的湿热灭菌，以及环氧乙烷（EO）气体、过氧化氢（H2O2）蒸汽和二氧化氯（ClO2）气体等多种灭菌工艺。这些灭菌工艺不仅是常用的灭菌手段，还具有不同的致死机制，如H2O2介导的能量转移、烷基化和氧化等，从而确保了研究的全面性和代表性。

研究对不同组别的生物指示剂在以下三种条件下进行评估：

1、未暴露：作为对照组。

2、暴露于各种灭菌过程：使30%-80%的生物指示剂检测结果为非无菌（即生长呈阳性）。在此条件下，部分生物指示剂无菌，部分非无菌，符合FDACDRH协议的要求。

3、根据特定公式计算的时间暴露：

依据ISO11138-1、ISO14161和美国药典中公布的计算存活时间（CST）公式确定暴露时间。

所有暴露后的细菌培养物均进行培养，直至观察到非无菌结果，或最长培养7天，通过培养基浑浊、pH指示剂颜色变化等证据判断非无菌结果。

二、关键发现：揭示生物指示剂生长规律

通过生长时间研究，获得了一系列与确定最短培养时间（MIT）密切相关的重要发现：

1、无论灭菌过程类型、致死机制以及生物指示剂上的孢子种类如何，生物指示剂生长时间范围近似正态分布。

2、暴露后的生物指示剂上存活孢子的数量与观察到的生长时间呈反比。即存活孢子数量较多的生物指示剂，其生长时间相对较短；反之，存活孢子数量较少的生物指示剂，生长时间则较长。

3、约1.1%的生物指示出现生长时间延长现象，这种现象在所有研究的灭菌过程中均有发生，且仅在灭菌暴露产生实验区结果时才会发生。

4、在CST条件下暴露的生物指示剂无生长时间延长情况，且生长时间更快更稳定。

三、旧方法局限：FDACDRH协议的争议

FDACDRH协议难以被广泛接受，主要原因在于缺乏测试结果来支持该方法及其接受标准。该协议要求进行三次灭菌暴露，每次使用100个生物指示剂，且需保证30%-80%的生物指示剂测试结果为非无菌；同时还规定缩短培养时间（RIT）与7天培养时间结果的相关性必须大于97%。然而，批评者认为，30%-80%的数值设定及相关性要求缺乏合理依据，国际社会普遍质疑其选择标准的科学性，但始终未有相关原理或测试结果能够对此进行证明。

从微生物暴露于灭菌过程的效应来看，在仅有两种可能结果（无菌或非无菌）的实验条件下，部分生物指示剂可能仅有一个孢子存活，其他生物指示剂存活孢子数量较少。仅有一个孢子存活的生物指示剂，其孢子可能未受严重损坏或受到严重影响，这会导致生长时间的显著差异。

根据泊松分布预测，当灭菌暴露使50%的生物指示剂为非无菌时，约35个生物指示剂仅有一个孢子存活，其余15个有两个及以上孢子存活，且仅有一个存活孢子的生物指示剂生长时间大多处于较窄范围，少数会出现生长时间延长。例如在湿热和环氧乙烷灭菌过程中，分别仅有2/458（0.44%）和3/309（0.97%）个生物指示剂出现生长时间延长的情况。

当暴露条件导致的无菌比例较低时（如35%与75%相比），更易出现生长时间较长的生物指示剂。以35%的非无菌结果为例，每个暴露的生物指示剂平均存活孢子数为0.43，而75%非无菌结果时平均存活孢子数为1.39。随着非无菌生物指示剂百分比降低，按比例来说，更多无菌生物指示剂将仅有一个有活力的孢子。因此采用CST计算所规定的暴露时间内处理生物指示剂，使存活孢子数量保持在较低水平，是开发可行MIT方法的重要前提。

四、新方法：基于CST的MIT测定方案

基于先前研究测试结果及数据分析，现提出确定生物指示剂最短培养时间（MIT）的新方法：

1、从三个批次中分别获取至少100个由不同孢子作物生产的生物指示剂。

2、测定每个批次生物指示剂的D10值和孢子数量。

3、运用公式计算每批生物指示剂的存活时间（公式：CST=D10值×[log10初始孢子数-2]，单位：分钟），该公式旨在使100%的生物指示剂检测结果为非无菌。

4、在CST条件下，通过单独的电阻计运行对每批生物指示剂进行暴露处理。

5、采用生物指示剂制造商指定的回收方法（或指定的生长培养基），并在规定的环境条件下操作。

6、持续培养，直至所有生物指示剂均检测出非无菌结果，或培养时间达到7天（若7天后仍未检测出非无菌，则需重新确认D10值和孢子总数）。

7、记录所有生物指示剂的非无菌测试时间。

8、MIT为三个生物指示剂批次中出现非无菌结果的最长时间。

在确定CST时，建议使用Holcomb-Spearman-Karber（微生物破坏定量检测数据分析方法）方法计算D10值。该方法利用一系列灭菌暴露中的所有分数阴性结果，计算“平均无菌时间”和相关的D10值。从统计学角度来看，这种方法计算出的D10值更有可能是最准确的，能够提供最佳的D10值估计。

五、新方法：契合现代灭菌监测需求

开发新的MIT测定方法需充分考虑灭菌过程监测和控制方法的发展。早期湿热灭菌器监测手段有限，生物指示剂测试结果对确定灭菌工艺有效性至关重要。而如今，灭菌过程在工艺验证框架下进行，现代灭菌器配备先进监测和控制系统，生物指示剂检测结果从属于记录的物理/化学结果，即便生物指示剂全部灭活，若物理/化学要求不满足，灭菌过程仍判定为不合格。

大量实验表明，未暴露与经过灭菌处理的生物指示剂孢子萌发和生长动力学存在差异，未暴露的生长速度快、时间变化小，经过灭菌处理的平均生长时间长、变化大。新提出的使用CST灭菌暴露的MIT方法，充分考虑了这种变异性，避免了“异常”结果的不当影响。相比之下，FDACDRH方案中30-80%的存活率窗口存在问题，其缩短培养时间（RIT）的结果常受仅有单个孢子存活的生物指示剂异常结果主导，缺乏稳健性和可重复性。

预计本文提出的MIT方法不会降低生物指示剂在监测和控制灭菌过程中的有效性，反而能提供可重复确定生物指示剂生长时间的可靠方法为生物指示剂在现代灭菌监测中的应用提供更科学、准确的技术支持。