基于方证代谢组学的云南白药配伍环境中草乌活血化瘀作用的药效物质基础研究

云南白药是我国具有自主知识产权的中药大品种，药用历史已有百余年。云南白药具有活血化瘀等作用，常用于治疗跌打损伤，临床疗效确切。2013年，香港卫生署发布新闻公报，因云南白药中含有未标示乌头类生物碱成分，指令药物进口商丰华（香港）公司回收云南白药散剂等5款云南白药中成药。草乌Aconiti Kusnezoffii Radix是云南白药不可或缺的主要药材，尽管在有效剂量及治疗周期内临床上未显示不良反应，但由于草乌含有乌头碱等有毒生物碱，云南白药被国际所排斥，严重地影响其有效利用及国际发展。

草乌为毛茛科植物北乌头Aconitum kusnezoffiiReichb.的干燥块根，始载于《神农本草经》。历代医家及本草著作称草乌“有毒”，需炮制或与其他中草药配伍后方可供内服使用。现代研究表明，人服用生草乌3～4.5 g可出现毒性反应，草乌对小鼠的半数致死量（ip）生用为0.19 g/kg，而炮制后则为6～10 g/kg。乌头类双酯型二萜生物碱既是草乌引起中毒的主要毒性物质，同时也是其主要的生理活性物质，已有草乌甲素[1-2]等作为药品应用于临床治疗疾病。研究表明，乌头碱类成分具有强心[3-4]、镇痛[5]、活血[6]、抗炎[7]、抗抑郁[8-9]、抗肿瘤[10-11]、抗氧化[12]、抗病毒[13]等药理作用。

从古至今，草乌的毒性众所周知，但由于其具有良好的活血化瘀功效，且药用价值高，在临床仍有较高的使用频率。科学评价草乌在云南白药配伍中的作用，揭示配伍环境下草乌发挥作用的药效物质基础，对充分发挥云南白药疗效、提高国际市场的份额具有十分重要的意义。本研究采用sc盐酸肾上腺素的方法复制血瘀证大鼠模型，利用方证代谢组学研究策略评价云南白药的活血化瘀作用，阐明血瘀证血液潜在生物标记物及云南白药调节的代谢经路，进一步表征与血液潜在生物标记物高度关联的血中移行成分，最终阐释云南白药配伍环境中草乌活血化瘀作用的药效物质基础。

1材料

1.1动物

SPF级雄性SD大鼠，9周龄，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，合格证号SCXK（辽）2015-0001。大鼠在SPF环境中饲养，环境温度（25±1）℃，相对湿度（50±5）%，12 h光/暗周期交替，自由进食饮水。动物实验经黑龙江中医药大学伦理委员会批准（批准号2019011501）。

1.2药品与试剂

云南白药（批号ZFA1621）由云南白药股份集团有限公司提供，按《中国药典》2020年版检验，结果符合规定；盐酸肾上腺素注射液（批号H12020526）购自天津金耀药业有限公司；氯化钠注射液（批号180923D7）购自哈尔滨三联药业有限公司；甲醇（色谱级，批号192934）购自德国Merck公司；乙腈（色谱级，批号194036）购自美国赛默飞世尔科技公司；甲酸（色谱级，批号193682）购自天津科密欧化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3仪器

Waters AcquityTM UPLC液相色谱仪、Waters Synapt G2-Si质谱分析系统（美国Waters公司）；Z30型全自动血流变测试仪（南京志伦科技有限公司）；KDC-160HR型高速低温离心机（科大创新股份公司）；AG135型分析天平（瑞士METTLER公司）；RVC 2-18 CD plus真空离心浓缩仪（德国Christ公司）；900系列超低温冰箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

2方法

2.1给药溶液的制备

取盐酸肾上腺素注射液，用生理盐水稀释为0.18 mg/mL的溶液；精密称取云南白药10.29 g，加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液500 mL，配制成质量浓度为20.58 mg/mL的溶液。

2.2分组、造模与给药

33只SD大鼠随机分为对照组、模型组和云南白药（180 mg/kg，相当于人体等效剂量）组，每组11只。除对照组外，其余大鼠sc盐酸肾上腺素（0.3 mg/kg），1次/d，连续7 d，制备血瘀证模型。给药组于第8天ig云南白药给药溶液，对照组ig等体积生理盐水，1次/d，连续给药15 d。

2.3样品采集

于实验第7天，腹主动脉采集对照组和模型组大鼠血液，于给药第15天采集云南白药组大鼠血液。采集血液（肝素钠抗凝血）1 mL用于全血黏度检测；血液于4 ℃、4 000 r/min离心15 min后，取血浆（肝素钠抗凝血）1 mL用于血浆黏度检测，取血浆（柠檬酸钠抗凝血）2 mL用于血浆凝血酶原时间、血浆凝血酶时间、纤维蛋白原检测。另采集血液3 mL，静置30 min，4 ℃、4 000 r/min离心15 min，取血清100 μL用于代谢组学分析。采集大鼠血液后，分别摘取大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏，生理盐水冲洗，滤纸擦拭干净表面水分后，称定质量，计算脏器指数，于10%中性甲醛中固定用于病理学检测[14]。

脏器指数＝脏器质量/体质量

2.4血清代谢组学分析

2.4.1样品制备 取大鼠血清100 μL，加入400 μL甲醇，混悬振荡60 s后，4 ℃、13 000 r/min离心15 min，于真空离心浓缩仪浓缩，用100 μL 50%甲醇复溶，混悬振荡60 s，4 ℃、13 000 r/min离心15 min，取上清液供液质分析。

2.4.2分析条件 使用Waters AcquityTM UPLC液相色谱仪串联Waters Synapt G2-Si质谱分析系统进行血清代谢组学分析。

（1）色谱条件：采用Waters Acquity UPLCTM HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱温35 ℃，体积流量0.4 mL/min，进样体积2 μL。流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，B为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～2.0 min，1%～30% A；2.0～3.0 min，30%～40% A；3.0～4.0 min，40%～50% A；4.0～5.0 min，50%～60% A；5.0～6.0 min，60%～65% A；6.0～7.0 min，65%～70% A；7.0～10.0 min，70%～99% A。

（2）质谱条件：毛细管电压分别为3.0 kV（正离子）、2.5 kV（负离子）；锥孔电压分别为30 V（正离子）、20 V（负离子）；去溶剂气温度为350 ℃（正、负离子）；去溶剂气体积流量为800 L/h（正、负离子）；离子源温度为110 ℃（正、负离子）；采用亮氨酸脑啡肽（[M＋H]+ m/z 556.277 1、[M－H]− m/z 554.261 5）进行质量校正，校正溶液体积流量为10 μL/min，校正频率为0.2 s；色谱仪流出液不经分流直接注入质谱仪进行正、负离子全扫描分析，扫描范围m/z 50～1 200。

2.4.3数据处理 数据采用Progenesis QI软件进行分析，得到的数据矩阵应用EZinfo 3.0软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），同时结合投影变量重要性（variable importance for the projection，VIP）值（VIP＞1）及组间t检验（P＜0.05）结果，筛选关键性的代谢产物。Mass FragmentTM应用管理器用于表征MS/MS碎片离子分析过程，在Metlin、HMDB和Chemispider数据库的基础上，利用MetPA软件对潜在的生物标志物进行重建、相互作用和路径分析，以分析生物标记物和确定代谢途径。

采用PCMS软件进行血中移行成分及血清代谢产物关联性分析，设置0.5≤|r|≤0.7为高度正（负）相关，0.7≤|r|≤1为极度正（负）相关；选择与血清代谢产物高度相关个数在5个及以上的血中移行成分，作为云南白药配伍环境中草乌活血化瘀作用的潜在药效物质基础。

2.5统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，结果以 表示，采用独立样本t检验。

3结果

3.1云南白药治疗血瘀证大鼠的疗效评价

3.1.1经典血液流变学及组织病理学评价 应用经典血液流变学及组织病理学评价云南白药治疗血瘀证大鼠的疗效，发现与对照组比较，模型组大鼠全血黏度及血浆黏度升高，凝血酶时间、凝血酶原时间缩短，血浆纤维蛋白原含量升高；模型组大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏均出现不同程度的血管扩张、充血、瘀血、水肿及炎细胞浸润等血瘀证的病理变化，其中以心脏及脾脏的改变最为显著。给予云南白药治疗15 d后，大鼠全血黏度及血浆黏度降低，血浆凝血酶时间、血浆凝血酶原时间均延长；各脏器瘀血、充血、水肿及炎细胞浸润等病理现象大部分消失，形态结构恢复完整、清晰，接近对照组大鼠，且云南白药对心脏、肝脏及肾脏瘀血的改善效果较好[14]。

3.1.2脏器指数评价 如图1所示，与对照组比较，模型组大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏指数稍有下降，肾脏指数稍有升高；给予云南白药治疗后，大鼠心脏、脾脏、肾脏指数升高，肝脏、肺脏指数降低，组间比较差异无显著性。

3.2云南白药治疗血瘀证的血清代谢组学研究

采用优化的色谱-质谱联用方法，将采集得到的对照组、模型组及云南白药组大鼠血清代谢轮廓数据（图2-A）输入Progenesis QI软件，各色谱峰经过匹配、提取、标准化流程后，将离子归一化，进行非监督型PCA，得到能反映组间变化趋势的得分图（图2-B、C），可见模型组、对照组及云南白药组聚类明显，组间分离。

根据关键性代谢产物的保留时间及精确相对分子质量，利用元素组成分析（分辨率＞10 000，精密度＜5×10−6），确定可能的化学式；以精确相对分子质量、可能的化学式及二级质谱数据为线索，检索HMDB数据库（http://www.hmdb.ca）等代谢产物和质谱数据库，进行质谱信息匹配，初步推测代谢产物的可能归属；进一步将匹配所得化合物及相应二级质谱信息输入Masslynx嵌套的Massfragment软件，根据化学结构裂解的可能性及生物质谱裂解规律，验证鉴定的有效性。如表1所示，从模型组大鼠血清样本中筛选出了包括赖氨酸、白三烯A4等在内的34个潜在生物标记物，其中正离子模式下13个、负离子模式下21个。经云南白药治疗15 d后，能回调血瘀证的23个潜在生物标记物，包括尿刊酸、焦谷氨酸等，其中13个有统计学意义（P＜0.05、0.01，图2-D）。将云南白药能回调的23个血瘀证血清潜在生物标记物进行MetPA分析，发现组氨酸代谢、鞘脂代谢、谷胱甘肽代谢、卟啉和叶绿素代谢、花生四烯酸代谢及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解为云南白药治疗血瘀证的关键代谢通路（图3）。

3.3云南白药配伍环境中草乌生物碱类血中移行成分与代谢标记物相关性研究

采用PCMS软件进行分析，分别计算云南白药配伍环境下草乌7个血中移行成分[15]与云南白药调节的23个血瘀证血清潜在生物标记物的Pearson相关系数，得到关联分析热图（图4），发现与5个及以上血清潜在生物标记物高度相关的血中移行成分为森布星B、异塔拉定、塔拉乌头胺及展花乌头宁。

4讨论

中药的药效物质基础研究是解读中药有效性及安全性等问题的关键环节，然而，由于中药方剂给药形式的特殊性及方证对应疗效的专属性，决定了中药药效物质基础研究的复杂性。以往关于中药药效物质基础研究已形成了许多行之有效的研究方法，如高通量活性筛选技术[16]、基于药效基团的虚拟筛选及分子对接技术[17-18]、网络药理学技术[19]等，在解决中药活性成分确认方面起到积极的促进作用。然而由于思路、方法及应用技术的局限，都在某些方面存在不可逾越的弊端，并不能使发现的所谓活性成分与中药的临床有效性直接相关联，致使实质性的中药药效物质基础研究寥寥无几，中药药效物质基础研究方法进展缓慢。方证代谢组学是利用代谢组学技术表征证候生物标记物及精准评价方剂效应，利用中药血清药物化学方法鉴定方剂表达疗效的体内显效成分，进而发现并确认与生物标记物高度关联的药效物质基础，从而阐明方剂效应成分及效应机制，解决中药有效性相关科学问题的系统科学[20-26]，为中药药效物质基础研究提供了新途径。

本研究应用方证代谢组学研究策略，在前期研究确证云南白药治疗大鼠血瘀证的有效性的基础上，首先应用代谢组学技术表征了血瘀证的34个血清潜在生物标记物、云南白药调节的23个血瘀证生物标记物及包括组氨酸代谢、花生四烯酸代谢、鞘脂代谢等在内的相关代谢通路。4-咪唑啉酮-5-丙酸、尿刊酸与组氨酸代谢密切相关。在肝脏中，尿刊酸由尿刊酸水合酶转化为咪唑-4-酮-5-丙酸，而4-咪唑酮-5-丙酸可以自发地衰变成4-氧戊二酸酰胺或甲酰基谷氨酰胺，并最终转化为谷氨酸[27]。尿刊酸是皮肤中的主要光线受体，以反式尿刊酸存在，经紫外线照射后转变为顺式尿刊酸。研究显示，血瘀型银屑病患者存在显著的代谢紊乱，特别是血脂代谢异常[28]。银屑病患者照射治疗后顺式尿刊酸含量增加，同时发现细胞活性明显降低，进一步实验证实尿刊酸降低细胞活性具有剂量相关性[29]。白三烯A4、前列腺素I2（prostaglandin I2，PGI2）、前列腺素B2（prostaglandin B2，PGB2）及血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）与花生四烯酸代谢密切相关。PGI2是一种强大的血管扩张剂，可抑制血小板黏附与聚集，防止在初级止血（血液凝块形成的一部分）中涉及的血小板栓塞的形成[30]。PGB2是PGJ2前列腺素类的代谢产物。TXB2在血小板释放反应中很重要，具有强烈的收缩血管、促进血小板聚集以及导致血栓形成等作用，跟踪检测TXB2含量可直观反映体内瘀血情况[31]。研究发现临床气虚血瘀证患者血液中TXB2含量升高[32]。TXB2作为血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）的降解产物，常被用于标志TXA2的产生水平和TXA2相关酶的活性[33]。研究证实以TXA2升高为主的TXA2/PGI2失衡是血瘀证的一个重要指标[34-35]。LysoPE[20∶5(5Z,8Z, 11Z,14Z,17Z)/0∶0]与LysoPE[20∶1(11Z)/0∶0]是溶血磷脂，与鞘脂代谢密切相关。溶血磷脂服务于重要的信号传导如溶血磷脂酸（lysophosphatidic acids，LPA）。LPA主要产生于血栓形成过程中被激活的血小板，可通过G蛋白偶联受体引起多种生物学效应[36]；LPA能够引起正常内皮的迁移，在伤口愈合、溃疡愈合以及血管再生中均发挥重要作用；此外，LPA也具有引起平滑肌收缩、血小板聚集的功能[37]。

进一步应用PCMS关联分析，得到与血清潜在生物标记物高度相关的4个血中移行成分，判定为云南白药配伍环境中草乌活血化瘀的潜在药效物质基础。本研究表征出的4个潜在药效物质基础成分均为胺醇型C19-二萜生物碱。研究表明，胺醇型C19-二萜生物碱对离体牛蛙心肌细胞损伤、大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用，对多种动物模型具有改善肌力作用和左室舒张功能等活性；进一步研究发现异塔拉定等醇胺型二帖生物碱是强心的活性成分。“心主血脉”，心脏的搏动可使血液在脉道中顺畅的运行，一旦心脏功能受损，血液运行不通畅则易形成“血瘀”[38]。

本研究采用方证代谢组学理论方法，建立云南白药配伍环境中草乌药效生物评价体系，提取与血瘀证标记物轨迹变化高度关联的草乌生物碱类成分，明确云南白药配伍环境中草乌活血化瘀作用的药效成分为森布星B、异塔拉定、塔拉乌头胺及展花乌头宁。本研究首次报道了云南白药中草乌生物碱类显效成分，在保证有效性和配伍的前提下，存在于可追溯药材中；从化学成分层面解释了云南白药临床使用剂量及组方的合理性，为提高云南白药的国际化进程和认可度提供了依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：韩 莹，董 辉，孙 晖，张清宇，陈 骜，杨 乐，王喜军．基于方证代谢组学的云南白药配伍环境中草乌活血化瘀作用的药效物质基础研究[J]. 中草药, 2025, 56(8): 2678-2686

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