Mol Ther丨乔云波/黄行许/陈军合作开发基于新型脱氨酶和线粒体转移的线粒体碱基编辑技术

人类线粒体基因组（mitochondrial DNA, mtDNA）是一种双链、环状、多拷贝的DNA分子。由于mtDNA缺乏组蛋白保护，且其复制和修复机制与核基因组相比存在显著差异和不完善特征，线粒体在能量代谢过程中产生的大量活性氧（ROS）极易对mtDNA产生损伤并诱导大量突变，主要包括点突变、插入/缺失和大规模重排，其中点突变最为常见。mtDNA突变会导致线粒体相关疾病发生，主要表现为神经和肌肉病变，包括遗传性视神经病变（LHON）、线粒体脑肌病伴高乳酸血症及卒中样发作综合征（MELAS）等。目前已发现与人类疾病相关的mtDNA单碱基突变有1000多种，如何精准构建mtDNA突变模型是研究和治疗线粒体突变相关疾病的关键。

随着从伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia）中发现具有双链DNA（dsDNA）胞嘧啶脱氨酶活性的BcDddA，研究人员开发了基于该脱氨酶的线粒体碱基编辑器DdCBE（也称mitoCBE），成功在mtDNA的5'-TC序列中实现精确的C•G-to-T•A转换（Nature, 2020）。在此基础上，研究人员通过对脱氨酶和辅助组分进行优化和改良，逐步实现了mtDNA的高效、无偏好、低DNA/RNA脱靶、单链和A-to-G编辑，并已广泛应用于小鼠、大鼠、斑马鱼和植物中的线粒体DNA编辑。乔云波团队亦在前期工作中，鉴定了一种无序列限制性的脱氨酶riDddA，开发了高效、无序列偏好性的mitoCBE（Mol Cell, 2023）。然而，考虑到序列环境和结构的复杂性，不同的mitoCBE在特定位点可能表现出不同的效率或偏好性，我们以期开发更高效、无核基因脱靶的多样化编辑工具，以满足不同场景和应用需求。

近日，上海交通大学第九人民医院/上海精准医学研究院乔云波课题组联合浙江大学附属第一医院黄行许教授、山东大学齐鲁医院陈军研究员在Molecular Therapy杂志在线发表了题为

An engineered mitoCBE facilitates efficientmitochondrial DNA editing and modifiedmitochondrial transfer

在该研究中，研究者通过对DddA同源类似物筛选，成功筛选了DddA类同源物BgDddA，基于该脱氨酶开发的线粒体碱基编辑器的效率显著高于传统BcDddA介导的DdCBE。为了消除TC序列偏好性，研究人员参考DddA11引入6个突变位点（S1328I，A1339V，N1340S, E1368K, T1378I，T1411I），并融合反式激活因子Rta，开发了新型碱基编辑器mitoCBE3.2，显著提高了BgDddA在非TC靶向位点的编辑效率。实验结果表明，融合Rta的新型线粒体碱基编辑器在多种细胞系（包括HEK293T、U2OS、Hela和hESC/mESC）中均展现出高效的编辑能力和广泛的适用性。

最后，研究人员利用新型线粒体碱基编辑器mitoCBE3.2，通过单克隆筛选，成功构建多种含有人类疾病相关mtDNA近纯合突变的细胞模型，其中包括与肺癌相关的线粒体致病突变细胞A549m.G13268A。为了避免线粒体基因编辑过程中引发的细胞核基因脱靶，研究人员利用线粒体转移技术，将体外编辑的含有疾病突变位点的线粒体移植到含有野生型mtDNA的细胞中，发现野生型mtDNA的占比会被稀释并与突变型mtDNA共存，成功构建被“间接编辑”的靶细胞，并发现野生型和突变型线粒体的竞争优势与突变类型有关。利用线粒体基因编辑+线粒体转移技术，成功实现了疾病模拟、mtDNA突变/SNV功能评估、线粒体突变校正。可以预见，我们还可在易转染细胞中进行线粒体编辑，获得纯合编辑的线粒体以后将其移植入原代细胞等难转染细胞，实现难编辑细胞的线粒体基因编辑。

该研究通过鉴定新型DddA同源物BgDddA，构建了精准、高效的新型线粒体胞嘧啶碱基编辑工具，证明了引入突变和融合Rta提高编辑效率、消除序列偏好性等工程化技术的有效性；结合线粒体转移技术，彻底避免细胞核基因组脱靶，在线粒体疾病模型构建、mtDNA突变功能评估、线粒体疾病治疗等相关基础研究中具有广阔应用前景。特别致谢南京医科大学沈彬教授对本论文的帮助和指导。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2025.03.051

乔云波课题组主要利用利用CRISPR、TALEN等系统，开发精准、高效的基因和表观基因编辑工具并构建疾病模型，解析基因/表观基因变异在人类疾病发生发展过程中的功能和调控机制，相关成果发表在Mol Ther 2024、Mol Cell 2023、Adv Sci 2022、Nature Commun 2021a/2021b/2020等。现因工作需要，诚聘对基因编辑和高通量筛选方向感兴趣的博士后2-3名。

课题组链接：

http://www.shipm.cn/jyjz_web/html/defaultsite/jyjz_kygl_kytd/Info/Detail_1713.htm

陈军研究员，课题组聚焦基因编辑及干细胞研究。因工作需要，诚聘基础生物学或医学类博士后2名。

课题组链接：

http://qlyxjxgl.sdu.edu.cn/jsxx/dylcxy/cj.htm

制版人：十一

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