《AM》南科大吴德成：通过蛋白质模板和机械训练协同策略的软骨适应性水凝胶

文章摘要

软骨作为高含水量的承重组织，具有优良的弹性和高强度。然而，开发软骨适应性生物材料来替代或再生受损的软骨组织仍然是一个巨大的挑战。作者将蛋白质模板化和机械训练相结合，制备了具有与软骨相似的机械性能和含水量的晶体介导的壳聚糖纳米纤维水凝胶（O-CN凝胶）。O-CN凝胶的水含量为1.74 wt%，具有高的拉伸强度（1.154 MPa）和杨氏模量（1.241 MPa），以及优异的生物相容性，抗溶胀性和抗菌能力。O-CN凝胶植入大鼠尾椎纤维环缺损模型后，可封闭软骨（纤维环）缺损，维持椎间盘高度，最终防止髓核突出。这种蛋白质模板和机械训练的协同策略为设计高度机械的水凝胶开辟了新的可能性，特别是用于承重组织的替换和再生。。

背景介绍

人体承重组织如骨骼肌、关节软骨等，常因运动、负重等活动承受强烈机械应力。高含水量的软骨，例如，需承受特定范围的弹性与压缩模量运动。这些组织一旦受损，需借助强健力学性能的生物材料进行修复。水凝胶作为一种高含水量的三维网络材料，在组织工程修复领域展现出广阔的应用前景。然而，大多数生物相容性水凝胶因机械性能不足，难以胜任承重组织的修复工作。尽管已采取多种策略来改善其机械性能，如化学/物理键耗散晶体结构形成等，但这些方法仍无法同时实现优异的机械性能与高保水性。例如，双网络水凝胶虽能通过物理交联提升机械性能，但在软骨工程修复中的表现仍显不足；聚乙烯醇（PVA）凝胶虽展现出肌腱水平的拉伸性能，但其生物相容性却令人担忧；缠结工程化的蛋白质水凝胶虽压缩性能出色，但拉伸性能和水含量却相对较低。壳聚糖作为一种天然碱性多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性和抗菌性，在组织工程中应用广泛。然而，壳聚糖膜在湿态下的机械性能较差，尽管可通过盐析效应等方法提高其力学性能，但低水含量仍限制了其在体内组织工程中的应用。未来，或可借助牺牲模板法开发3D网络支架，为解决这一问题提供新思路。

结果与讨论

图1.晶体介导的取向壳聚糖纳米原纤水凝胶（O-CN凝胶）的制备示意图。

作者提出了一种新的协同策略，通过蛋白质模板化和机械训练在壳聚糖水凝胶中实现组合的高机械性能和高含水量性能（图1A）。该体系通过在碱性条件下牺牲蛋白质体，将双网络壳聚糖/蛋白质（明胶或丝素蛋白）水凝胶（DNCG凝胶）转化为物理交联的单网络壳聚糖纳米纤维水凝胶（CN凝胶），通过疏水作用和氢键作用形成晶体介导的无规CN水凝胶（R-CN凝胶）。在机械训练后，这些R-CN凝胶沿着拉伸方向排列以形成晶体介导的定向CN水凝胶（O-CN凝胶），其具有与软骨（纤维环）的结构相似性（图1B）。这些O-CN凝胶表现出极高的拉伸强度、模量和断裂韧性，达到软骨水平的机械性能（图1C）。此外，O-CN凝胶具有与软骨的含水量相似的高含水量、优异的生物相容性、抗菌性和抗溶胀性。

图2CN凝胶的成分及形貌表征。

壳聚糖和明胶被用作模型系统，通过牺牲明胶配位网络和机械训练来制备超高强度和富含水的O-CN凝胶（图1A）。CG凝胶的扫描电子显微镜（SEM）图像具有大孔（图2A）。ii）CG凝胶中的明胶网络在用乙醇（EtOH）的部分脱水过程中变得更加紧密（图2B）。此外，在乙醇处理条件下，CG凝胶中的壳聚糖链通过疏水相互作用形成网络，从而形成双网络CG凝胶（DN CG凝胶）。在暴露于氢氧化钠（NaOH）溶液时，产生具有光滑表面和随机纳米纤维的R-CN凝胶（图2C）。所得R-CN凝胶是透明的，并且可以承受扭曲（图2D）和打结（图2 E）的变形。明胶的FTIR光谱显示出三个特征峰：酰胺I带、酰胺II带（和酰胺III带（图2F）。壳聚糖粉末和壳聚糖-NaOH凝胶具有明显的特征吸收峰，分别对应于壳聚糖的酰胺I带和NH 2吸收峰（图2F）。在CG凝胶的情况下，酰胺带中的峰位置与明胶相似（图2F），而R-CN凝胶的峰与壳聚糖粉末和壳聚糖-NaOH凝胶相当。所得R-CN凝胶未显示明胶的相关特征峰，这证明CG凝胶中明胶降解（图2F）。为了进一步证明明胶在NaOH溶液中的降解，使用异硫氰酸荧光素标记的明胶（FITC-明胶）来构建CG凝胶。如图2G所示，NaOH浸泡溶液中FITC的荧光强度随着FITC-明胶降解而增加，在120 min时达到最大荧光强度，这与初始重量的FITC-明胶的相同荧光强度一致（图2 H）。综上所述，上述结果表明DN CG凝胶中的明胶在NaOH溶液中被牺牲以形成单一网络R-CN凝胶。最后，将R-CN凝胶沿着拉伸方向排列，以在机械训练后形成取向的纳米原纤壳聚糖凝胶（O-CN凝胶）（图2 I）。图2 J显示了R-CN凝胶的平滑表面，而O-CN凝胶在训练后表现出由互连取向的纳米纤维组成的中孔网络（图2K）。此外，根据O-CN和R-CN凝胶的横截面形态，与R-CN凝胶不同，O-CN凝胶显示出圆形球体或圆形结构（图2 J;和图2K）。

图3.DN CG和R-CN凝胶的机械性能表征。

当在EtOH中处理时间增加时，DN CG凝胶的拉伸强度也增加（图3A）。这种力学性能的提高主要归因于CG凝胶的明胶化，因为明胶在与EtOH的部分脱水过程中可以形成更强的内部氢键。如图3B所示，随着NaOH处理时间增加，R-CN凝胶的拉伸强度也增加，而R-CN凝胶的模量几乎保持不变。当NaOH浓度增加时，R-CN凝胶的断裂韧性和拉伸应变下降（图3C）。这种力学性能的下降主要是由于R-CN凝胶在高浓度NaOH溶液中的物理交联密度过大，影响了壳聚糖链的缠结和壳聚糖晶体的形成。所开发的R-CN凝胶具有显著的承重能力，可承受1 kg重量（图3D），而明胶或壳聚糖-NaOH凝胶太弱且易碎，无法承受此重量。对于以下实验，从用1 m NaOH处理24小时的CG水凝胶获得R-CN凝胶。R-CN凝胶不仅具有优异的拉伸性能，而且在80%压缩应变下显示出21.2 MPa的应力（图3E）。在该压缩条件下，R-CN凝胶保持完整形状，而CG凝胶容易破裂（图3F）。R-CN凝胶能够在40%压缩应变下承受10000次连续压缩-松弛循环，载荷损失小于35%（图3G）。在10000次连续压缩-松弛循环后，R-CN凝胶的压缩模量增加，R-CN凝胶的压缩应力也对应提高（图3 H）。这些结果表明，R-CN凝胶可以实现高的机械性能，通过氢键和疏水相互作用的壳聚糖纳米纤维链与NaOH处理。通常，水凝胶具有高机械性能，但保水性低。然而，所获得的R-CN凝胶保持75重量%的相对高的水含量（图3 I）。

图4 机械训练后O-CN凝胶的力学性能表征。

拉伸测试在O-CN凝胶上以平行（平行）和垂直（垂直）取向与对齐的纳米纤维进行（图4A）。O-CN凝胶（OCN）的拉伸强度为，几乎是O-CN凝胶（OCN）的拉伸强度的三倍（图4 B）。O-CN的模量和断裂韧性。O-CN凝胶（OCN）的模量和断裂韧性也高于O-CN凝胶（OCN）（图4C、D）。此外，与R-CN凝胶相比，O-CN凝胶的拉伸强度从11.8 MPa增加到15.4 MPa，模量从4.2 MPa增加到24.1 MPa，断裂韧性从8.5 MJ m − 3增加到13.4 MJ m−3，使其能够承受2 kg的重量（图4 E）。O-CN凝胶的机械性能的这些增强可以归因于结晶区域的重排和相邻的壳聚糖链之间的氢键的增加，从而导致在机械训练后密集堆积的壳聚糖纳米纤维和水合壳聚糖晶体。作者比较了不同水含量下壳聚糖基水凝胶和常用材料的拉伸强度（图4F），作者观察到制备的O-CN凝胶表现出更高的拉伸强度和弹性模量，几乎匹配软骨的机械性质（图4G）。高含水量和抗溶胀性能使O-CN凝胶非常适合应用于软骨工程修复。

图5. CN凝胶上的晶体排列表征。

20 °和8.2°的相同峰对应于壳聚糖晶体的（020）反射和（200）/（220）反射（图5A）。与R-CN凝胶相比，O-CN凝胶在20°处的峰变窄，表明机械训练后O-CN凝胶的晶体尺寸增加。图5 B显示R-CN凝胶的热分解温度为194 °C，而O-CN凝胶的温度为220 °C。这些结果表明，与R-CN凝胶相比，O-CN凝胶表现出更高的热稳定性。R-CN凝胶显示出各向同性的Debye-Scherrer环，其峰为（200/200），表明晶体的随机排列（图5C，i）。随着机械训练期间的循环力从10 N增加到50 N，O-CN凝胶的（200/200）反射变得更强，表明壳聚糖晶体的重排和O-CN凝胶的增强的各向异性（图5C）。同时，O-CN凝胶的强度和取向因子（f）也增加（图5D、E），进一步表明随着力的增加，取向得到改善。总的来说，O-CN凝胶具有高的机械性能，这是由于CN凝胶的结晶区域在机械训练后的重排。

图6. 大鼠模型中O-CN凝胶的放射学评估。

为了探索O-CN凝胶在体内促进纤维环修复的效率，作者在大鼠中建立了尾椎缺损模型。治疗后4周和8周，采用放射学和组织学评估评价椎间盘退变（图6A）。与对照组相比，O-CN凝胶在DHI方面表现出显著差异，而在治疗4周时，在O-CN凝胶组和假手术组之间未观察到显著差异（图6 B、C）。术后8周后，与对照组相比，O-CN凝胶组显示出更大的椎间盘高度保留，表明O-CN凝胶治疗有效缓解了IVD退变的进展（图6D）。然后，进行T2加权共振成像（MRI），以评价核的含水量（图6 E）。O-CN凝胶组的含水量与假手术组相似，但在治疗4周后显著高于对照组（图6 F）。随着时间的推移，O-CN凝胶组和对照组之间的含水量差异显著增加，在术后8周时变得更加显著（图6 G）。Pfirrmann分类显示，在4周和8周时，与对照组相比，O-CN凝胶组的瓣膜退行性变程度较低（图6 H，I）。这些影像学结果表明，与对照组相比，O-CN凝胶在延迟瓣膜随时间的退变方面具有显著优势。

图7.大鼠模型中O-CN凝胶的组织学评价。

在8周椎间盘切除术后，对照组中存在严重破坏伴髓核突出（图7A）。在给药后4周和8周后，对照组严重萎缩，蛋白聚糖区颜色较浅，而O-CN凝胶组轻微退化，与假手术组相似（图7 B）。为了进一步评价椎间盘的修复效率，使用免疫组织化学分析评估聚集蛋白聚糖（ACAN）和I型胶原（Col I）的表达水平（图7 C、D）。假手术组和O-CN凝胶组在第4周和第8周时显示出最低等级，表明瓣膜变性较少（图7 E-G）。总之，这些组织学发现证明原位植入O-CN凝胶有效地愈合了环缺损并减轻了椎间盘的退变。

图8. 高强度CN凝胶设计的通用方法。

作者推测其他蛋白质也可以作为牺牲体来制备高强度CN凝胶。为了验证这种可预测的一般性，作者使用丝素蛋白来制造CN凝胶。FTIR图像显示了丝纤蛋白在NaOH溶液中的降解（图8A）。采用Cy5.5-标记丝素蛋白追踪降解过程（图8B）。结果表明，标记的丝纤维在90分钟内降解。SEM表征表明，所得R-CN（SF）凝胶显示出粗糙的表面（图8 C），而O-CN（SF）凝胶在机械训练后显示出粗糙的纤维表面（图8D），呈现出与使用明胶牺牲制备的R-CN凝胶和O-CN凝胶相似的趋势。O-CN（SF）凝胶的杨氏模量、断裂韧性、拉伸强度和应变分别达到10.6 MPa、10.6 MJm-3、12.8 MPa和193%（图8 E），其也可以承受1 kg的重量（图8 F）。与O-CN凝胶相比，O-CN（SF）凝胶的力学性能较低，这可能是由于明胶和丝纤维之间氨基酸组成和空间结构的差异造成的然而，当与其他物理或化学交联壳聚糖/丝纤蛋白凝胶相比时，O-CN（SF）凝胶具有优异的保水性和优异的机械性能，使它们更好地与软骨的力学相匹配（图8 G）。因此，牺牲网络和机械训练策略可以应用于不同的蛋白质，以制造高强度CN凝胶。

文章总结

综上，作者成功地开发了一种新的方法，通过结合牺牲天然网络体与机械训练过程来制备超强和高含水量的O-CN凝胶。明胶在氢氧化钠溶液中降解形成晶体介导的无规凝胶（R-CN凝胶）。经过机械训练后，R-CN凝胶沿拉伸方向沿着排列，导致高拉伸强度（15.4 MPa）、模量（24.1 MPa）和断裂韧性（13.4 MJ m−3）的O-CN凝胶的再生。此外，该方法还使O-CN凝胶具有较高的含水量（约74wt%）、良好的生物相容性、抗菌性和抗溶胀性。该方法的通用性通过其对明胶和丝素蛋白作为牺牲网络的适用性来证明。卓越的机械性能、高含水量和抗溶胀特性使这些O-CN凝胶非常适合软骨修复。最终，所得到的OCN凝胶可以防止核突出，保持高水化，并通过大鼠尾椎缺损保持椎间盘高度，显示出负载软骨工程的潜力。未来的努力可以针对定制的OCN凝胶的性能，以满足在大型动物模型中的组织工程的特定要求。

文章信息

Zhou D, Wang W, Ma W, et al. Cartilage‐Adaptive Hydrogels via the Synergy Strategy of Protein Templating and Mechanical Training[J].

Adv. Mater.

来源：超分子光化学与自组装