中科院1区: 中国中医科学院中药所揭示当归素激活HIF-1α乙酰化改善溃疡性结肠炎

溃疡性结肠炎（UC）是一种全球性的顽固疾病。四神丸合痛泻要方（SSP-TXYF）是一种中药复方制剂，被广泛用于治疗溃疡性结肠炎，但其制备较为复杂。本研究对 SSP-TXYF 的成分进行分析，以找到一种能治疗 UC 的天然化合物，并验证其疗效和机理，旨在探索与 SSP-TXYF 具有相同疗效的新天然化合物。

结果表明，当归素（Ang）是四神丸合痛泻要方（SSP-TXYF）的主要活性成分。结合还原二甲基标记和串联正交蛋白水解-基于活性的蛋白质谱分析（rdTOP-ABPP）以及网络药理学，发现ERK1/2和HDAC1可能是结合蛋白。随后证实 Ang 不仅能抑制脂多糖诱导的 IEC-6 炎症，还能有效抑制 2,4,6- 三硝基苯磺酸诱导的体内 UC。增加丙酸盐和丁酸盐的浓度，激活 GPR43 和 GPR109A 受体，增加 ERK1/2 活性，促进 Sp1 磷酸化，从而竞争性抑制 HIF-1α 和 HDAC1 的结合，最终增加 HIF-1α 的乙酰化是 Ang 的分子信号转导机制。

研究表明，Ang能改善大鼠UC症状，激活结肠上皮细胞的GPR/ERK/SP1/HDAC1/HIF-1α通路，修复受损的肠粘膜屏障（IMB）。Ang的关键药效学机制与SSP-TXYF一致，初步认为Ang可作为一种治疗UC的新型天然药物。

一、SSP-TXYF 抗 UC 作用的 Q 标记预测分析

图1 根据 Q 标记预测，Ang 是 SSP-TXYF 的主要活性成分

• 根据 Q 标记的测定结果预测了 SSP-TXYF 的潜在活性成分。主成分分析图（PCA）显示，同组样品具有良好的聚集度，说明实验数据可靠。为了消除大鼠内源性物质对含 SSP-TXYF 血清分析鉴定的影响，将大鼠对照血清作为阴性对照，最大程度地准确分析和鉴定 SSP-TXYF 在血清中的吸收情况。根据假设，模型大鼠体内含有的 24 种原型成分有可能成为 SSP-TXYF 药理作用的关键活性成分。

• 根据定性分析结果和药理研究报告，选择了 12 种成分作为特征成分进行同步定量测定。对 SSP-TXYF 和含 SSP-TXYF 血清中的这 12 种代表性成分进行了定量分析，每组 3 个三重样。与模型大鼠含 SSP-TXYF 的血清中的其他成分相比，柚皮苷（485,310 ng/mL）和当归素（Ang）（2525 ng/mL）的含量相对较高。柚皮苷在 SSP-TXYF 中含量最高，但很容易水解，且没有关于治疗 UC 的报告，因此选择 Ang 进行后续研究。
  

二 、通过网络药理学和基于 rdTOP-ABPP 的化学蛋白质组学鉴定 SSP-TXYF 靶标

图2 根据网络药理学预测，HIF-1 信号通路是主要通路

而 HDAC1 是主要靶点

• 从 TCMSP 共鉴定出 663 种治疗靶点衍生化合物，并使用 UniPort 数据库调整了其基因名称。从 GeneCards、OMIM 和 DrugBank 数据库中收集了 2452 个 UC 相关靶点。通过维恩图确定了 SSP-TXYF 靶点与 UC 靶点之间的 286 个重叠基因。为了识别具有直接或间接相互作用的靶标，将这 286 个重叠基因导入 STRING 数据库并构建了 PPI 网络。PPI 网络由 284 个节点和 8599 条边组成。根据其 DC、BC 和 CC 值确定了核心靶标。度值最高的蛋白质靶标是 HDAC1。将靶标分为两组（，进一步研究 SSP-TXYF 在 UC 中的功能，对 286 个重叠靶标进行KEGG富集分析，发现 HIF-1 信号通路与 UC 的发生发展密切相关。
  

图3 对 IEC-6 中与 SSP-TXYF 相互作用的蛋白质

进行 rdTOP-ABPP 分析

• 通过化学蛋白质组学鉴定 SSP-TXYF 的潜在传感器。首先通过凝胶内荧光检测了IA在IEC-6裂解液中的效率。将 IEC-6 裂解液与 100 μM 的 IA 培养 1 小时，同时加入阴性对照和联合处理不同浓度 SSP-TXYF 的竞争样本。SDS-PAGE分离探针标记的蛋白质，并用凝胶内荧光显像。在体外实验中，IA 被 SSP-TXYF 有效地竞争掉，表明它在 IEC-6 蛋白质组中有广泛的蛋白质相互作用。

• 将 IA 探针与定量质谱分析相结合，鉴定了 IEC-6 蛋白质组中与 SSP-TXYF 相互作用的蛋白质。LC-MS/MS分析后用 CIMAGE对二甲基标记比率进行量化，从而得到每个已鉴定蛋白质-Rcomp 的比率。三个生物重复中进行了化学蛋白质组分析，只有满足以下所有条件的蛋白质才会被指定为 SSP-TXYF 相互作用的靶标：(1) 它必须在所有三个重复中被量化；(2) 平均 Rcomp ≥ 1.5 且计算出的 p 值 < 0.05（图 3D）。根据这些标准，共鉴定出 266 个与 SSP-TXYF 相互作用的蛋白质。对这 266 个靶标进行了 KEGG 分析，结合网络药理学和 rdTOP-ABPP 的结果，推测 SSP-TXYF 的结合靶点主要集中在位于 HIF-1 信号通路上的 ERK1、ERK2 和 HDAC1 蛋白上。
  

三、当归素可改善 UC 模型中的炎症和 IMB 功能

图4 Ang 可改善 TNBS 诱导的大鼠 UC 症状

• 大鼠灌肠注射2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导UC模型，Ang 每天灌胃一次，连续八天。结果表明，Ang 对大鼠的体重和结肠长度有保护作用。疾病活动指数（DAI）评分显示，Ang 能明显改善 UC 大鼠的疾病症状。与正常大鼠相比，模型大鼠血清中的 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平明显升高。Ang剂量依赖性地降低了血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。

• 这些结果表明，Ang 对 TNBS 诱导的大鼠 UC 有明显的保护作用。
  

图5 Ang 可增强 IMB 的功能

• 评估大鼠的病理状况、杯状细胞数量和 IMB 相关蛋白指数。模型组表现出严重的损伤，包括隐窝变形、固有膜和粘膜下层炎性细胞浸润以及杯状细胞脱落，这些损伤在 Ang 治疗组明显减轻。在脂多糖（LPS）诱导的 UC 大鼠和 IEC-6 模型中，Ang 能显著增加 IMB 相关蛋白指数，包括 zonula occludens-1 (ZO-1)、Mucin-2 (MUC2)、occludin 和 claudin-1。这些发现表明，Ang 的预防作用与修复受损的 IMB 无关。
  

四、当归素通过抑制 HDAC1 的活性调节 HIF-1α 乙酰化

图6 血管紧张素通过抑制 HDAC1 增加 IEC 中 HIF-1α 乙酰化的表达

• CETSA-WB结果显示，与DMSO组相比，当Ang与HDAC1结合时，IEC-6细胞的热稳定性增加。WB结果显示，与模型大鼠相比，Ang处理大鼠的HDAC1水平明显受到抑制。这些结果证实 Ang 调节 HDAC1 的表达。

• 进一步探讨 Ang 对 HIF-1α 的影响，HDAC1 是一类蛋白去乙酰化酶，能调节 HIF-1α 乙酰化/去乙酰化的平衡，因此研究 Ang 是否能调节 HIF-1α 的乙酰化表达。与 UC 组相比，Ang 处理能显著增强 HIF-1α 乙酰化。共免疫沉淀（Co-IP）观察到 Ang 抑制了 HDAC1 和 HIF-1α 之间的直接相互作用。腹腔注射特异性 HDAC1 激动剂 ITSA-1 后，Ang 不能调节 HIF-1α 的乙酰化水平，也不能影响 HIF-1α 与 HDAC1 的相互作用。这些数据表明，Ang 抑制了 HDAC1 的表达，从而使 HIF-1α 乙酰化/去乙酰化的平衡向乙酰化倾斜。
  

五、当归素调节 HIF-1α 乙酰化以保护 IMB

图7 激活 HDAC1 可逆转 Ang 介导的对 IMB 损伤的改善作用

• 使用 ITSA-1 激活了 HDAC1 的表达，并检测了 IMB 相关指标。ITSA-1 激活 HDAC1 会抵消 Ang 对 UC 大鼠的保护作用，包括体重、DAI 评分、结肠长度和炎症因子。ITSA-1 的激活逆转了 Ang 介导的 IMB 损伤改善效应，包括结肠病理状态、杯状细胞数量和 IMB 相关蛋白。这些发现表明，Ang 可抑制 HDAC1，进而调节 HIF-1α 乙酰化，达到保护 IMB 的目的。
  

六、当归素通过激活 ERK/Sp1 信号通路介导对 HDAC1 表达的抑制

图8 血管紧张素通过激活 ERK/Sp1 信号通路抑制 HDAC1 的表达

• 使用CETSA-WB和分子对接来探讨ERK1/2与Ang的结合能力。细胞CETSA-WB结果显示，与DMSO组相比，当Ang与ERK1/2结合时，IEC-6细胞的热稳定性增加。IEC-6和HT-29细胞的免疫荧光实验和UC大鼠的WB实验结果显示，与模型组相比，Ang处理后ERK1/2的水平显著升高。这些结果证实ERK1/2是Ang的靶点。

• 推测Ang 是通过激活 ERK/Sp1 信号通路来抑制 HDAC1 的表达，结果发现 Ang 确实能显著提高 Sp1 的磷酸化水平。通过检测 IEC-6 细胞核和细胞质中的蛋白含量，发现 Ang 主要提高了细胞质中 ERK1/2 的水平和细胞核中 Sp1 的磷酸化水平。为了探讨ERK1/2在Ang处理后调控HDAC1表达中的作用，用ASN007苯磺酸盐抑制ERK1/2的转录活性，并检测了磷酸化Sp1和HDAC1在IEC-6中的表达。结果表明，在 LPS 诱导的 IEC-6 中，ASN007 苯磺酸盐抑制了磷酸化-Sp1 的蛋白水平，同时增加了 HDAC1 的水平，这表明 ERK/Sp1 在 Ang 控制 HDAC1 表达的过程中发挥了作用。
  

七、当归素介导丙酸和丁酸调节ERK/Sp1信号传导

图9 血管紧张素通过丙酸盐和丁酸盐介导 GPR 受体进入 IEC，从而调节 ERK/Sp1 通路

• 在胃肠道内，结肠上皮细胞会优先吸收短链脂肪酸（SCFA）作为能量来源，从而促进上皮细胞增殖并帮助损伤修复，因此对结肠中的 SCFAs 数量进行了量化。通过 PCA，观察到 SCFAs 在对照组、模型组和 Ang 组之间有明显的聚类。与 UC 组相比，Ang 组丙酸盐和丁酸盐的相对丰度显著增加。这些结果表明，在 UC 模型中丙酸盐和丁酸盐的产生受到干扰，而 Ang 逆转了这些变化。
  

• 假设 Ang 通过激活 GPR43/GPR109A 介导丙酸盐和丁酸盐调节 ERK/Sp1，实验结果证实 Ang 会增加 UC 大鼠结肠、LPS 诱导的 IEC-6 和 HT-29 中 GPR43 和 GPR109A 的水平。为了研究 G 蛋白偶联受体在 Ang 诱导的 ERK1/2（调控 HIF-1α 乙酰化的上游蛋白）增加中的作用，用 GPR43 拮抗剂 GLPG0974 或 GPR109A 拮抗剂 Mepenzolate bromide 处理了 LPS 诱导的 IEC-6 12 小时。发现抑制 GPR43 或 GPR109A 可减轻 Ang 诱导的 ERK1/2 在 IEC-6 中的积累，还能阻止 Ang 诱导的 IEC-6 中 Sp1 的磷酸化表达。这些数据共同证明，GPR43 或 GPR109A 在 Ang 促进 ERK 诱导磷酸化 Sp1 的过程中发挥了重要作用。
  

研究结论

结合 Q 标记和 rdTOP-ABPP 策略，研究发现Ang 对 HIF-1 信号通路中 HDAC1 和 ERK1/2 蛋白的影响是 SSP-TXYF 治疗 UC 的重要机制。研究结果表明，Ang 可以缓解 UC 的症状，且Ang的效果与临床上经典的抗UC药物SASP的治疗效果相当。 Ang 抗 UC 作用的基本机制之一是修复受损的 IMB，通过增加丙酸盐和丁酸盐的浓度，激活GPR43和GPR109A受体，提高ERK1/2的活性，促进Sp1磷酸化，从而竞争性抑制HIF-1α和HDAC1的结合，最终增加HIF-1α的乙酰化。该研究表明，Ang有可能发展成为一种潜在的抗UC天然药物。

图10 研究概要示意图

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