《食品科学》：江苏大学袁丽教授等：虾肉蛋白在乳酸菌发酵过程中的降解及其体外抗氧化活性的动态变化

虾肉作为一种重要食材，因含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质等营养成分而广受消费者喜爱。高营养、高含水量和相对活跃的蛋白酶使虾在贮存和加工过程中极易发生腐败和氧化，最终导致品质劣化。

青虾（Macrobrachium nipponense）是我国主要的淡水养殖虾类之一。课题组前期利用乳酸肠球菌发酵青虾虾肉得到高品质凝胶产品的同时，发现经发酵后产品中可溶性肽含量显著升高（P＜0.05）。由微生物发酵产生的氨基酸及肽不仅可以改善食品的质地和风味，还具有很多生物活性功能。课题组前期研究发现，通过乳酸菌发酵可以促使虾糜形成凝胶。然而，随着发酵时间的延长，虾糜蛋白的降解程度增加，同时可溶性肽含量上升。肌原纤维蛋白（MP）和肌浆蛋白（SP）是虾肉中的主要蛋白质成分。

江苏大学食品与生物工程学院的熊治渝、孙兰静、袁丽*等研究分别以虾肉中的MP和SP为对象，接种乳酸肠球菌进行发酵处理，动态监测发酵过程中两种蛋白的降解及其抗氧化活性变化，以期为新型虾产品及抗氧化肽的开发提供新的思路。

1 发酵过程中虾糜凝胶可溶性肽含量的变化

TCA-可溶性肽含量可以反映蛋白质的降解程度。如图1所示，样品中TCA-可溶性肽质量浓度随发酵时间的延长而逐步增加，发酵24 h后发酵组显著高于对照F0（

P

＜0.05），表明蛋白可能在内源性蛋白酶和微生物蛋白酶的作用下发生降解，生成小分子肽和氨基酸。与蛋白质相比，除了作为基础营养物质，多肽还可能因具有其他生物活性，如抗氧化性、抗炎、抗菌及更高的消化率，而赋予食品更多的营养功效和更高的接受度。

2 虾糜MP和SP在发酵过程中微生物数量的变化

如图2所示，随着发酵时间的延长，MP和SP中的菌落总数和乳酸菌数整体呈先上升后下降的趋势。0 h时MP和SP的菌落总数分别为7.18（lg（CFU/mL））和7.14（lg（CFU/mL）），两者之间无显著差异（

P

＞0.05），乳酸菌数分别为7.10（lg（CFU/mL））和7.13（lg（CFU/mL））（P＞0.05）。发酵12 h后，微生物数量迅速增加，MP和SP菌落总数分别增加了1.41、1.17（lg（CFU/mL）），乳酸菌数分别增加了1.30、1.10（lg（CFU/mL））；微生物可能充分利用了体系中的葡萄糖（碳源）和发酵产生的肽或氨基酸（氮源）进入对数生长期。12～36 h时，MP组中菌落总数和乳酸菌数维持稳定，而SP组中菌落总数和乳酸菌数持续上升，24 h时达到9.08（lg（CFU/mL）），之后急剧下降；这可能是发酵体系中的pH值接近MP的等电点（pH 5.0～5.2），使其发生了较大程度的聚集，限制了酶对蛋白质的可及性，最终降低了体系中微生物可利用的氮源释放；相比之下，SP结构较为松散，更容易被蛋白酶降解，可为微生物生长提供充足的氮源；发酵48 h后由于营养物质的消耗和不良代谢物的积累，MP组和SP组的微生物数量均出现下降趋势，其中SP组下降趋势较为明显。值得注意的是，发酵0～24 h过程中SP的乳酸菌数在菌落总数中的占比相对较高，在此阶段SP中的乳酸菌可以较大程度地抑制杂菌生长，并可能提高蛋白质的降解度。

3 虾糜MP和SP在发酵过程中pH值和蛋白酶活力的变化

如图3A所示，与未发酵时相比，经发酵后两种蛋白的pH值均显著下降（

P

＜0.05）。两组蛋白pH值的变化趋势基本一致，均为先下降后保持稳定；MP和SP的初始pH值分别为6.90和6.91，12 h时迅速下降至4.85和4.81，24 h时为4.65和4.70。pH值的降低通常与乳酸菌数及其代谢产生的有机酸有关，这与微生物数量的变化趋势一致；蛋白质降解产生肽、氨基酸和氨等碱性物质，可能是导致发酵后期pH值上升的原因。

如图3B所示，两组样品中蛋白酶活力呈现相同的变化趋势，均为随发酵时间的延长而升高。发酵前SP组和MP组的蛋白酶活力分别为3.29 U/mL和3.28 U/mL，12 h时显著上升，分别为6.47 U/mL和6.23 U/mL（

P

＜0.05）；48 h时为11.28 U/mL和10.99 U/mL（

P

＜0.05）。除0、36 h外，发酵过程中SP组中的蛋白酶活力均显著高于MP组（

P

＜0.05）。发酵过程中蛋白酶的活力通常与微生物数量呈正相关，与pH值呈负相关，这与本实验结果一致。

4 SDS-PAGE分析

如图4所示，SDS-PAGE显示了发酵期间两组蛋白的降解情况，MP和SP均出现了不同程度的降解。发酵12 h时，MP的肌球蛋白重链（200～220 kDa）、肌动蛋白（45 kDa）、肌球蛋白轻链（21 kDa）均呈现出明显的降解趋势；24 h降解程度进一步加剧，在100、60 kDa左右处出现了新的条带，小分子质量（＜15 kDa）条带灰度进一步加深（图4A），可能归因于低分子质量的肽和游离氨基酸的产生。如图4B所示，与MP相比，SP降解速度更快、程度更加明显；发酵12 h时，200、130 kDa处的蛋白条带强度出现显著降低，60、45 kDa左右的蛋白条带完全消失，70～90、26～34 kDa处及小分子质量（＜17 kDa）蛋白条带灰度明显增强；发酵36 h时甘油醛脱氢酶（34 kDa）蛋白条带消失；发酵48 h时肌酸激酶-M型（42 kDa）条带几乎消失。以上结果表明，在接种乳酸肠球菌的发酵体系中，SP更容易发生降解，这可能是因为其具有相对松散的结构，更容易被蛋白酶识别和降解；蛋白质的降解除了与内源酶活性有关，还可能受到乳酸菌数量与代谢的影响，在本研究中表现为SP组中乳酸菌占比更大；此外，Nie Xiaohua等将乳酸菌接种到香肠中，同样发现蛋白发生了较大程度的降解。

5 虾糜MP和SP在发酵过程中DH和肽质量浓度的变化

如图5A所示，随着发酵时间的延长，SP组的DH呈现持续上升的趋势，而MP组的DH无显著变化（

P

＞0.05）；在发酵48 h过程中SP组的DH始终显著高于MP组（

P

＜0.05）；0 h时SP组的DH显著高于MP组（

P

＜0.05），说明在初始阶段SP中就可能含有更多的α氨基酸或小分子肽；48 h时SP和MP组的DH分别是0 h的1.21 倍和1.10 倍，表明SP组的最终DH增长程度显著高于MP组，此结果与SDS-PAGE结果（图4）相印证。如图5B所示，两种蛋白中肽质量浓度的变化均呈现先下降后上升的趋势；0～48 h，SP组的肽质量浓度显著高于MP（

P

＜0.05），与DH测定结果相似；12 h时两组肽质量浓度均显著下降（

P

＜0.05），而12 h后缓慢上升。

在发酵过程中，对蛋白质起降解作用的酶有内源性蛋白酶和微生物酶；内源性蛋白酶在发酵初期起主导作用，可将初始蛋白或肽转化为氨基酸、酮酸、醛等化合物，导致肽质量浓度降低；微生物酶如由乳酸菌产生的胞外蛋白酶（氨肽酶、二肽酶、三肽酶等）则在发酵后期起主导作用，可将蛋白质或肽进一步降解为氨基酸或更小的肽，其中分子质量小于3 kDa的肽具有更高的抗氧化能力。发酵初期，体系内的氨基酸作为氮源供给微生物的生长（图2），这可能是12 h时MP水解度下降的原因，而SP水解度未下降可能归因于其起始阶段较高的肽含量，使得氨基酸的生成量与消耗量相当。

6 虾糜MP和SP的抗氧化活性分析

体外抗氧化实验是评价物质抗氧化活性的常用方法，根据氧化方式不同可分为自由基清除能力测定（如ABTS阳离子自由基、DPPH自由基、羟自由基等）和还原能力测定等。本研究采用ABTS阳离子自由基、DPPH自由基、羟自由基清除能力和Fe3+还原能力实验综合评价了两组蛋白发酵体系中肽的抗氧化能力。

ABTS阳离子自由基清除率可以反映体系内包括亲水性和疏水性肽在内的总抗氧化活性。如图6A所示，SP组和MP组的ABTS阳离子自由基清除能力均随发酵时间的延长而增加，且SP组显著高于MP组（

P

＜0.05）；发酵48 h时MP和SP组的ABTS阳离子自由基清除率分别为47.11%和80.05%，显著高于未发酵的MP和SP（

P

＜0.05）。结果表明，通过乳酸菌发酵可以显著提高两种蛋白体系的抗氧化能力，而SP组具有较高的降解度、可溶性肽或氨基酸含量，可能是其具有较高抗氧化活性的主要原因。

DPPH自由基清除能力主要反映疏水性物质的抗氧化特性。如图6B所示，两种蛋白肽的DPPH自由基清除能力及变化趋势不同，MP组先上升后下降，而SP组呈现持续上升的趋势；发酵结束时两组DPPH自由基清除率均显著高于未发酵时的蛋白（

P

＜0.05）。在0～24 h内，MP组的DPPH自由基清除率高于SP组，其中12 h时MP组显著高于SP组（

P

＜0.05），可能是由于在此发酵阶段MP降解产生了更多的疏水性抗氧化肽，这可能与MP的一级结构直接相关，或与体系内蛋白酶的催化特异性相关。综合ABTS阳离子自由基清除率分析结果，SP组中可能含有更多的亲水性抗氧化肽；24 h后MP组的DPPH自由基清除率降低，SP组则持续上升，36 h时SP组的DPPH自由基清除率显著高于MP组（

P

＜0.05）。发酵后期MP组抗氧化活性降低的原因可能是抗氧化肽在蛋白酶的作用下持续降解。

如图6C所示，SP组的羟自由基清除率呈现下降趋势，而MP组无显著变化，这表明通过乳酸菌发酵两种蛋白均不能得到具有高羟自由基清除能力的肽。如图6D所示，两组蛋白发酵后肽的Fe3+还原能力均显著增加（

P

＜0.05），且SP组的还原能力更强；48 h时MP和SP组的Fe3+还原能力分别为87.60%和92.11%。

值得注意的是，SP组在肽质量浓度下降的过程中抗氧化活性仍呈现上升趋势；推测决定肽抗氧化能力的因素除了肽质量浓度，其氨基酸序列和末端结构可能是影响其抗氧化能力的另一重要因素；有些氨基酸如酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸，可以通过直接或间接与自由基发生反应而起到抗氧化作用；此外，如果肽的N末端和C末端存在特定的化学官能团，如羟基、硫醇基、羧基等，它们也可以通过与自由基发生反应或提供电子给自由基，从而发挥抗氧化作用。

7 相关性分析

分别对MP和SP发酵体系中的微生物数量、蛋白酶活力、pH值、DH、抗氧化能力进行相关性分析，结果如图7所示。MP和SP组的菌落总数和乳酸菌数呈显著正相关（

P

＜0.01、

P

＜0.001），可以推测乳酸菌是发酵体系中的主要微生物；菌落总数、乳酸菌数与pH值呈显著负相关（

P

＜0.05、

P

＜0.01、

P

＜0.000 1），表明细菌尤其是乳酸菌的生长和代谢可能是导致体系pH值下降的主要原因；在发酵体系中，尤其是SP组的蛋白酶活力与DH、ABTS阳离子自由基清除率、DPPH自由基清除率以及Fe3+还原能力呈显著正相关（

P

＜0.05、

P

＜0.01），由蛋白酶活力升高导致的蛋白质降解可能是提高抗氧化能力的关键因素；除SP组的肽质量浓度和羟自由基清除率外，pH值与蛋白酶活力、其他的抗氧化能力呈负相关，表明pH值的降低在一定程度上可以提高酶活力和抗氧化能力。综上所述，乳酸菌可能通过提高菌落总数、酶活力和降低pH值从而提高蛋白发酵体系的肽含量及其抗氧化能力。

结论

本实验探究了虾肉蛋白在发酵过程中水解和抗氧化活性的变化规律。结果表明，接种乳酸肠球菌S15可以通过增加发酵体系中菌落总数、降低pH值和提高蛋白酶活力等方式促进MP和SP的降解、提高肽的生成及抗氧化性能；未发酵的SP体系中含有更多的抗氧化物质，发酵使其变化更为明显。本研究可以为水产蛋白尤其是SP的充分利用和抗氧化肽的开发提供参考。

作者简介

1

第一作者

熊治渝 实验师/硕导

熊治渝，博士，实验师，江苏大学硕士生导师，中国食品科学技术学会会员。主要从事水产品加工与营养健康、水产品发酵与风味品质变化等方面的研究。主持或参与市厅级以上项目7 项，发表学术论文20余篇。

2

通信作者

袁丽 教授/博导

袁丽，教授，江苏大学博士生、硕士生导师。长期从事食品化学与营养、水产品加工及贮藏等方向的基础和应用研究。主持或参与国家自然科学基金、国家重点研发等项目10余项；获省部级奖励2项；授权国家发明专利10余件；发表学术论文50余篇。

本文《虾肉蛋白在乳酸菌发酵过程中的降解及其体外抗氧化活性的动态变化》来源于《食品科学》2024年45卷第22期 65-72页，作者：熊治渝，孙兰静，张倩倩，高瑞昌，袁 丽*。 DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240418-178. http://www.spkx.net.cn点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：申婧婧 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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