南京农业大学张文利课题组建立一种鉴定开放染色质的新方法

在真核生物基因组中，开放染色质通常富含启动子、增强子等DNA顺式调控元件 (Core et al., 2014; Heintzman et al., 2009)，对基因转录 (Adelman and Lis, 2012)、DNA复制(MacAlpine and Almouzni, 2013)、重组修复 (Clouaire and Legube, 2019; Hauer and Gasser, 2017; Lamm et al., 2021)及应激响应 (Zhu et al., 2013)等一系列生物学过程具有重要的调控功能。特别是近年来，关键功能元件的基因编辑有利于农作物重要农艺性状的协同改良 (Rodríguez-Leal et al., 2017; Song et al., 2022; Wang et al., 2022; Yao et al., 2024; Zhou et al., 2023)。目前，已报道有多种方法如DNase-seq (Boyle et al., 2008; Zhang et al., 2012a; Zhang et al., 2012b)、ATAC-seq (Buenrostro et al., 2013; Lu et al., 2017)、MNase-based MH-seq (Zhang et al., 2023; Zhao et al., 2020)及NOMe-seq (Rhie et al., 2018)等可用于绘制全基因组开放染色质的图谱，但每种方法均不能提供一个基因组近饱和的开放染色质位点（OCSs），且部分OCSs具有方法的特异性 (Nordström et al., 2019; Song et al., 2011; Zhao et al., 2020)。因此，与现有方法具有互补性的新方法的建立将有助于挖掘基因组中一些方法特异性的OCSs及其功能解析，进而丰富调控染色质组学的研究。

近日，南京农业大学张文利教授课题组在Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“ISDH-seq: a robust methodology for profiling and characterization of open chromatin”的研究论文。该研究提供了一种鉴定开放染色质位点的新方法，简称为原位DNase I超敏测序技术（ISDH），绘制了全基因组开放染色质并初步解析了该方法特异的位点的表观特征及其生物学功能。

ISDH-seq可用于鉴定不同细胞数量样品的OCSs，最低可用于5万个细胞核规模的样品。在一定条件下，该方法通过优先切割并原位标记生物素偶联的dATP和dCTP，通过捕获生物素标记的开放染色质区DNA，结合测序分析鉴定基因组中OCSs的一种策略。与DNase-seq和ATAC-seq相比，在同一批次的样品中，该方法可鉴定较多的OCSs，该方法特异性的OCSs具有独特的表观遗传特征：低DNA甲基化水平、富集H3K27me3抑制性组蛋白标记以及与三维染色质互作位点具有较高的关联度。

在水稻基因组中，ISDH-seq、DNase-seq和ATAC-seq分别鉴定了62,750, 36,474和28,498个OCSs，其中21,877个为共有OCSs，而ISDH特异的OCSs（27,296个）数量最多。亚基因组的分布结果显示，ISDH-seq的 OCSs更多的富集在3’UTR区域，而DNase-seq的OCSs在5’UTR和基因下游富集程度更高。综上所述，ISDH-seq可用于进一步丰富水稻基因组的调控染色质景观。

图1. 三种不同开放染色质方法产生的数据集的比较分析

真核生物基因组中，OCSs是基因表达调控的核心因素之一。分析结果显示，在转录起始位点（TSS）附近，多种方法共有的及ISDH特异性的OCSs与基因表达水平呈正相关性，而在基因体内，OCSs与基因表达水平呈负相关性，并且ISDH特异的OCSs关联的基因更倾向于组织以及胁迫特异性表达。

图2. 不同亚类的OCSs与基因表达的关系分析

结合表观多组学数据，较系统地解析了不同亚类的OCSs的表观特征。结果显示，ISDH特异的OCSs具较低的CHG甲基化水平和最低的CHH甲基化水平。组蛋白修饰聚类分析结果显示，部分ISDH特异的OCSs显著富集了H3K27me3（聚类簇2），与其关联的基因的表达水平最低，暗示了这部分OCSs与抑制性表观标记（如H3K27me3）一起协同调控基因的表达。

图3. 不同亚类的OCSs的表观遗传学特征分析

进一步研究结果表明，富含H3K27me3的ISDH特异的OCSs关联的基因更倾向于组织以及胁迫特异性表达，并通过转录因子网络调控内源刺激以及胁迫响应相关的基因表达。其中，在盐胁迫相关网络中，在盐胁迫下，基因LOC_Os09g23620的启动子区的染色质开放性增强，通过纳米瞬时转化实验验证了该OCS具有增强子功能。上述结果表明，H3K27me3与OCSs一起共同调控植物对胁迫的响应。

图4. H3K27me3写富集的ISDH特异的OCSs的功能表征

此外，除直接调控相关基因表达外，OCSs还能够通过染色质环间接调控基因的转录。研究发现，ISDH特异的OCSs参与远程调控的频率最高，且调控基因的数量更多，并且受到多个反式OCSs共同调控的ISDH特异的OCSs关联的基因表现出更高的进化保守性。因此，在反式调控基因的转录和驯化方面，不同亚类的OCSs存在功能差异。

图5. 不同亚类的OCSs的反式调控作用分析

综上所述，该研究开发了ISDH-seq用于绘制作物调控染色质的图谱，它与现有方法存在较强的互补性。多种方法选择性应用，有助丰富作物调控染色质组学的研究，有助于挖掘方法特异的OCSs功能位点，解析其生物学功能并为作物育种利用提供潜在的候选位点。

南京农业大学博士研究生李兆国、闰永行以及已毕业硕士生杨滢为论文共同第一作者，张文利教授为论文通讯作者。俄罗斯科学院西伯利亚分院（SB RAS）Gennadii Borovskii博士等也参与了该项研究。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金和江苏省研究生科研与实践创新计划等项目的资助。同时感谢南京农业大学作物遗传与种质创新利用全国重点实验室及南京农业大学生物信息学研究中心为本研究提供的支持。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.70069