江苏
在RNA逆转录及荧光定量实验中，新手研究者常遭遇目标基因扩增失败或检测CT值异常偏高的现象，这通常指示着目标基因未能有效扩增或其在模板中的表达水平极低，此情况在两步法荧光定量实验中尤为常见。探究其潜在原因，可能涉及RNA逆转录效率低下、荧光定量模板遭受污染，以及两步法检测灵敏度局限等多方面因素。
为应对此问题，首先是确保RNA能够高效逆转录。鉴于某些RNA模板内含复杂的二级结构或高GC含量片段，需提升温度以促进RNA变性，而传统二代逆转录酶在高温下的稳定性往往不足，导致部分基因片段逆转录效率低下。鉴于此，新手研究者可优先考虑采用第三代逆转录酶，该酶相较于二代酶具有更优越的耐高温性能，可将逆转录温度提升至55℃，从而有效规避RNA复杂二级结构对cDNA合成的抑制作用，确保荧光定量结果的准确性。
其次，舍弃两步法改用一步法进行实验，即将RNA逆转录和荧光定量在同一反应管内一步完成，不仅降低了两步法中因开管操作而引入的污染风险，而且使得逆转录产物得以全部用于荧光定量检测，从而在灵敏度上实现了对两步法的显著提升，可达十倍之多。对于低丰度基因的检测而言，此方法尤为适宜。同时，一步法在操作层面更为简便，新手研究者更易上手，可有效降低实验失败的概率！
综合上述两点，我们可以选择配有第三代逆转录酶的一步法荧光定量试剂盒来进行实验，如BIOG的BIOGHCElitefast SYBR One Step Kit，如下是实验测试数据，小伙伴们可以了解一下哦~
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