中国科学院团队代谢工程改造大肠杆菌，高效合成依克多因

四氢嘧啶又称依克多因（ECT），是一种氨基酸衍生物，对核酸、蛋白、生物膜以及细胞具有修复和保护作用，广泛应用于化妆品、生物制剂、酶工业和医疗等领域。

近年来，开发高水平生产依克多因的微生物菌株成为备受关注的研究方向。近日，来自中国科学院等离子体物理研究所姚建铭、陈祥松等在 ACS Synthetic Biology 发表题为“Multistep Metabolic Engineering of Escherichia coli for High-Level Ectoine Production”的研究。

天然大肠杆菌缺乏依克多因的合成途径，因此需要引入外源基因来建立依克多因生产的代谢途径。首先，通过引入嗜盐菌 H. elongate 的 ectABC 基因簇，得到重组菌株 HeEct00，ECT 滴度为 0.72 g/L。

ectABC 操纵子编码了参与 ECT 生物合成最后步骤的三种关键酶，这三个基因的协调表达对 ECT 合成至关重要。最初，使用不同的核糖体结合位点 (RBS) 强度来调节这三种酶的表达。然而，与原始菌株相比，这些菌株的 ECT 产量并没有显著提高。为了解决这个问题，研究人员调节了 5′-UTR 的强度，设计了不同强度的 5′-UTR 序列来替换 ectA、ectB 和 ectC 的天然 RBS 。结果表明，高 ectB 表达水平显著促进了 ECT 的积累，HeEct17 产生最高的 ECT 滴度 1.21 g/L。

天冬氨酸 (ASP) 是 ECT 合成中的关键前体，而草酰乙酸 (OAA) 是 ASP 的直接前体。因此，增强草酰乙酸的代谢途径对于 ECT 的生产必不可少。为了增加草酸乙酰的供应，研究人员将编码大肠杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）的天然启动子替换为 PT7，并用 PT7 替换丙酮酸羧化酶的天然启动子，增强丙酮酸到草酰乙酸的积累。结果表明 ECT 的滴度有所增加。为了进一步提高草酰乙酸的积累，编码柠檬酸合酶（一种关键的 TCA 循环酶）的 gltA 被下调，破坏从 OAA 到 TCA 循环的代谢通量。

天冬氨酸可在大肠杆菌中通过 TCA 代谢途径由 OAA 或延胡索酸生成，天冬氨酸脱氢酶（aspC）和天冬氨酸氨裂解酶（aspA）是 ASP 生物合成途径中的关键酶。为了进一步增加 ASP，将由 PT7 启动子驱动的 aspC 和 aspA 整合到 HeEct304 基因组中，分别获得菌株 HeEct310 和 HeEct311。

结果表明，过表达 aspC 的菌株在 55 小时时积累了 2.51 g/L 的 ECT。为了进一步将 OAA 转向 ASP 生成，来自铜绿假单胞菌的异源基因 aspDH（编码天冬氨酸脱氢酶）在强 PT7 启动子下整合到 HeEct310 的基因组中，产生菌株 HeEct312。 最终，该菌株的 ASP 代谢通量增加，但 ECT 滴度与 HeEct310 保持相似。

苹果酸是草酰乙酸的前体，为了增加苹果酸的供应，在 HeEct312 中敲除了编码乙醛酸抑制基因的 iclR ，产生了菌株 HeEct313。得到 2.71 g/L 的 ECT。

由此可见，简单地上调或下调 TCA 循环对促进 ECT 生物合成没有显著的好处。因此，研究人员考虑动态调节 TCA 循环以提高 ECT 生产率。首先，敲除菌株 HeEct313 中的 adhE 基因，这种缺失可以提高 ECT 滴度。在此基础上，用不同启动子替换原有 gltA 启动子。发现 EctRE03 菌株中 ECT 积累最快，54 h 时 ECT 滴度达到 3.11 g/L，表明启动子 PfliC可提高 ECT 产量。

大肠杆菌中天冬氨酸转化为 ECT 涉及五个步骤。第一步由 AK 催化，尤为关键。但将 lysC（编码 AK）引入启动子 PT7 控制下的 EctRE03 基因组中，得到的工程菌株 EctRE07 的 ECT 滴度并未显著提高，可能是因为 AK被 l-赖氨酸和 l-苏氨酸抑制。同时删除 lysA（它将代谢流从 ASP 引导到 l-赖氨酸），ETC 滴度增加。

前期实验发现，HeEct309、HeEct313、EctRE09 在摇瓶发酵过程中表现出较高的 SET 值，说明单菌产量较高。为了进一步验证这 3 株菌株的 ECT 生产特性，在 5 L 生物反应器中进行补料发酵，3 株菌株表现出不同的 ECT 生产特性。

HeEct309 的 ECT 滴度达到 37.1 g/L；HeEct313 的 ECT 滴度达到 53.7 g/L；EctRE09 的 ECT 滴度达到 118.5 g/L。在 3 株菌株中，EctRE09 在相同培养条件下表现出最高的 ECT 产量。这强调了动态调节 gltA 表达，结合 lysA 敲除和 lysC 过表达，在促进高效 ECT 合成方面的有效性。

总而言之，本研究通过系统代谢工程获得了高效生产 ECT 的大肠杆菌菌株。通过修改基因簇 ectABC 的 5′-UTR 序列以构建高表达基因簇、非 TCA 循环丰富前体草酰乙酸 (OAA) 和天冬氨酸 (ASP) 库、动态调节 TCA 循环增加生物量、阻断副产物途径以减少碳耗散、过表达关键代谢节点表达基因并调节反馈抑制来实现的。

最终，通过多步代谢工程在 EctRE09 中实现了高效的四氢嘧啶生产，ECT 滴度达到 118.5 g/L，净产量为 246.25 g，高于其他重组大肠杆菌菌株。尽管成功获得了高产菌株，但该菌株的生物量仍然很低，主要是因为 l-赖氨酸表达下调。未来的工作将集中于细胞生长和 l-赖氨酸生物合成的动态调节，以进一步提高 ECT 的产量。

1.https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acssynbio.4c00876

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