浙江
【写在前面】：本期推荐的是由辽宁中医药大学等研究团队近期发表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示淫羊藿提取物通过靶向调控ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬治疗肝细胞癌。
【期刊简介】
【题目及作者信息】
The pathogenesis of hepatocellular carcinoma: ERK/ULK1/ NCOA4-mediated inhibition of iron autophagy, and Epimedium extract targeted modulation of this pathway to treat hepatocellular carcinoma
背景：肝细胞癌（HCC）的发病机制具有复杂性和多样性，涉及糖酵解、自噬及细胞免疫等过程。值得注意的是，以往研究未曾报道过ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬抑制在HCC发病机制中的作用。本研究对HCC发病机制作出新阐释，并依据此机制将临床辅助治疗药物淫羊藿（Epimedium）确定为潜在疗法。该研究阐明了淫羊藿在治疗HCC时对ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬抑制通路的调控作用，为临床治疗策略及创新药物研发提供了科学依据。
目的：本研究旨在揭示HCC发病机制新方面，即ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬抑制，并依据此机制筛选临床靶向辅助治疗药物。
方法：采用N-亚硝基二乙胺（DEN）诱导建立HCC大鼠模型。借助体重、脏器指数等指标评估HCC大鼠生理状态。通过苏木精-伊红（HE）染色及生化标志物对HCC大鼠肝脏损伤情况进行评估。同时，运用非靶向代谢组学探索HCC发病机制。采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）结合网络药理学阐明新机制、预测通路靶点、筛选活性成分及分析淫羊藿（EPME）调控的生物过程与信号通路。用不同浓度EPME处理DEN诱导的肝癌大鼠，并通过Western blot分析评估蛋白表达水平。利用分子对接技术评估EPME核心成分与靶蛋白的结合亲和力。采用HepG2肝癌体外模型并结合抑制剂（SBI-0206965）验证EPME及其活性成分对ERK/ULK1/NCOA4信号通路的调控作用。采用微尺度热泳（MST）技术验证EPME核心成分与ULK1蛋白的结合能力。
结果：代谢组学结合网络药理学揭示了HCC一种新的发病机制，即ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬抑制。淫羊藿通过淫羊藿苷、黄芪苷、大黄素等活性成分可激活ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬，从而改善患HCC大鼠的存活条件，减轻肝脏损伤和致癌性，最终在HCC治疗中取得疗效。
结论：ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬抑制是HCC治疗新机制。临床辅助药物淫羊藿提取物（EPME）通过激活ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬，可能对HCC发挥治疗作用。
（图文摘要）
【前言】
肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，死亡率位居肿瘤第二位。肝细胞癌（HCC）约占肝癌病例的 90%，对人类健康构成重大威胁，并且是一个紧迫的全球卫生挑战。目前，手术治疗主要适用于早期肝癌，而中晚期肝癌的治疗则主要依赖药物管理。研究表明，HCC 的发病机制与糖酵解、自噬以及细胞免疫等机制有关。然而，由于 HCC 发病机制的复杂性和多样性，目前对其认识仍然不完整，需要进一步研究其具体机制。因此，推进 HCC 发病机制的研究并开发针对性的治疗药物是当务之急。
近期研究强调了在 MAPK 信号通路中，EGFR/ERK 轴在 HCC 的发生和发展中起着关键作用，影响着 HCC 细胞的增殖、侵袭和转移。此外，铁蛋白自噬的关键受体 NCOA4 在 HCC 中过度表达，导致铁自噬通量增加，进而使 HCC 细胞内自由铁水平升高，引发芬顿反应，产生过多的活性氧（ROS），从而抑制 HCC 的增殖。研究表明，NCOA4 介导的铁自噬受 MAPK 信号通路调控。基于代谢组学与网络药理学的结合研究，本研究发现 EGFR/ERK 和 NCOA4 均对 HCC 的发生发展产生影响。因此，推测 EGFR/ERK 与 NCOA4 介导的铁自噬之间存在密切联系，并初步推断 ERK/ULK1/NCOA4 可能会刺激 HCC 细胞中的铁自噬。
根据现代研究，EGFR/ERK 突变出现在多种癌症中，包括肝癌、肺癌和食管癌，影响癌细胞的增殖和迁移。此外，文献表明，PI3K/AKT/mTOR 自噬可以抑制胰腺癌；UBE2F-SAG 轴介导的 RHEB 增强 mTOR 活性，加剧肝癌的发展；PINK1 影响线粒体铁积累，促进结肠癌；而 NCOA4 介导铁自噬并影响胃癌的发生。上述研究确定了 EGFR/ERK 信号与自噬反应在多种癌症类型发病机制中的关系。通过相关文献研究，还发现铁自噬在 HCC 发展中的作用与其它癌症中的作用存在差异。然而，到目前为止，尚未建立 EGFR/ERK 与 ULK1/NCOA4 介导的铁自噬之间的联系。
淫羊藿最早记载于《神农本草经》，目前在临床上作为一种中药制剂，用于抗肿瘤单体联合治疗。它在治疗 HCC 方面表现出显著的疗效，与单一疗法相比，能显著提高患者的存活率。现代药理学研究表明，淫羊藿主要通过减轻炎症反应和调节免疫功能来抑制肿瘤生长。然而，目前尚无关于 ERK/ULK1/NCOA4 介导的铁自噬在 HCC 治疗中的应用报道。本研究旨在探讨 HCC 的新发病机制，并筛选针对这些新发现通路的临床相关辅助药物。
【结果】
1、大鼠生理指标
对照组大鼠健康，毛发亮泽，行为正常，而模型组大鼠食欲、活动力下降，毛发晦暗杂乱。在EPME治疗期间，药物组大鼠状态优于模型组，毛发更光滑整洁，无严重脱发、掉牙等不良症状。模型组大鼠体重显著低于对照组（
p< 0.01 ），而EPME治疗组体重高于模型组和CTX组（
p< 0.01 ），表明EPME提高了肝癌大鼠的生活质量，并呈现出明显的量效关系（图1A）。
随着肝组织充血和炎症的发展，肝体比增加，预示着肝脏病理变化。结果显示，模型组的肝指数显著高于对照组（
p< 0.01 ），而治疗组的肝指数低于模型组（p < 0.01）。EPME高剂量组的肝指数与CTX组相近（p > 0.05）。同时，胸腺和脾脏反映免疫状态，可间接评估药效。模型组脾脏指数升高，胸腺指数显著降低（
p< 0.01），表明免疫功能下降。EPME组脾脏指数下降，胸腺指数随剂量增加而升高（
p< 0.01），接近对照组水平。CTX组与模型组在脾脏和胸腺指数上无显著差异（
P>0.05），说明CTX在治疗肝癌的同时损害免疫功能，而EPME在保护免疫系统方面优于CTX（图1B）。
大鼠肝脏组织评估及HE染色
对照组大鼠肝脏组织柔软、亮泽、呈红色。相比之下，模型组肝脏组织变硬，布满大的白色囊泡状结节，部分直径超过1.5毫米。而EPME剂量组的肝脏组织比模型组更柔软，白色结节更少，表面有一些小丘疹样突起，呈剂量依赖性。CTX组肝脏组织与对照组相似，表面更光滑，但颜色稍暗，EPME高剂量组与CTX组相似（图1C）。
在显微镜下（200倍）观察各组大鼠肝脏组织的HE染色情况。对照组大鼠肝小叶结构清晰，排列整齐，大小一致，胞浆均匀，核大而圆。模型组个别肝小叶中完全纤维化细胞的核呈蓝色染色且聚集，肝细胞之间界限模糊，出现如脂滴聚集的小空泡。与模型组相比，其余各组肝脏组织结节更少，更接近对照组。其中，EPME高剂量组和CTX组的肝细胞最接近对照组（图1D）。这些结果表明EPME对肝癌的治疗效果与CTX相当。
大鼠生化指标检测
对各组大鼠血清中甲胎蛋白（AFP）、谷氨酰转肽酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）、afu（AFU）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）这五个指标的水平进行了统计分析（图1E）。与对照组相比，模型组这五个指标的表达显著升高（
p< 0.01）。相对于模型组，EPME组这五个指标的水平显著降低（p < 0.01），并且随着剂量的增加而降低。此外，EPME高剂量组对上述指标的调节作用与CTX相当（
p> 0.05），除了GGT显著改善（
p< 0.01）。
2、大鼠肝细胞癌的发病机制
为了进一步探讨肝细胞癌的发病机制，通过非靶向代谢组学分析研究了肝癌大鼠的血清代谢。OPLS-DA结果显示，对照组和模型组大鼠分布在两个区域，表明DEN诱导的肝癌大鼠体内代谢发生了变化。此外，正负离子模式下的R²和Q²值接近1，表明模型的准确性和预测能力良好（图2A-B）。通过比较对照组和模型组之间的差异代谢物，发现肝癌大鼠体内共有48种化合物发生变化（FC≥2且p < 0.05），主要涉及甘油磷脂代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚生物合成、萜类骨架生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化以及谷胱甘肽代谢（图2C，表1，表2）。
使用EPME对肝癌大鼠进行干预，并比较了EPME高剂量组、对照组和模型组之间的差异。结果表明，PCA图显示各组之间存在分散，表明EPME影响了肝癌大鼠的代谢（图2D）。此外，OPLS-DA结果显示，EPME组大鼠更接近对照组（图2E）。在EPME组和模型组之间鉴定了40种差异代谢物（FC≥2且p < 0.05）（表1），其中12种显著上调，28种下调。相关的代谢途径与肝癌大鼠观察到的相似（表3，图2F），其中甘油磷脂代谢是最显著的途径，也存在于肝癌大鼠中。关键差异代谢物是MEA和PE，它们与MAPK信号通路中的EGFR/ERK信号高度相关（Yang等，2024）。通过文献研究发现，EGFR/ERK信号通路影响肝细胞癌的发生和发展（Han等，2023）。
3、淫羊藿（EPME）成分分析
本研究采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）对淫羊藿（EPME）进行分析。通过与文献和标准物质对比，在正负离子模式下准确鉴定出EPME中的24种化合物（图3A-B）。此外，口服给药后，在血液中检测到27种化合物，包括20种原型血成分和7种代谢产物（表4、表5，图3C-D）。
4、ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬抑制对HCC的发生发展影响
通过网络药理学分析，从口服进入血液循环的27种EPME化学成分中获得245个靶点。从疾病数据库中筛选出3356个与HCC相关的靶点，其中135个与EPME潜在靶点重叠，可能是EPME治疗HCC的潜在靶点（图4A）。基于蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络信息进行分析（图4B），其中黄芪苷、大黄素、淫羊藿苷、山柰素-3-O-鼠李糖苷和新橙皮苷影响核心靶点（图4C），可能在EPME治疗HCC中发挥类似调节作用。基于Metascape数据库（ ）分析，EPME治疗HCC最显著的通路是癌症中MAPK的EGFR/ERK信号通路（图4D）。NCOA4是核心靶点之一，是介导铁蛋白自噬、影响HCC发生发展的重要靶点（秀等，2022）。本研究结合代谢组学与网络药理学初步推测，EGFR/ERK与NCOA4介导的铁自噬和HCC之间存在密切联系。通过Western blotting实验进一步筛选验证ERK/ULK1/NCOA4的上下游靶点。
5、EPME靶向抑制ERK激活ULK1/NCOA4治疗HCC
Western blotting结果显示，EPME显著降低HCC大鼠中EGFR、KRAS、P-ERK、P-TSC2、Rheb和P-mTOR水平（
P<0.05，
P<0.01），增加自噬启动因子P-ULK1（ser317）水平（
P<0.05），激活自噬。此外，还显著降低自噬底物SQSTM1/p62水平（
P<0.01），增加铁蛋白吞噬标志物NCOA4水平（
P<0.05，
P<0.01）。此外，EPME组中铁蛋白标志物FTH1（
P<0.01）和GPX4（
P<0.01）水平也降低（图5）。以上结果证实，EPME靶向抑制ERK可激活ULK1/NCOA4信号通路，在HCC治疗中发挥作用。
6、分子对接分析结果
已有研究表明，EGFR/ERK信号通路可影响下游自噬通路（邓等，2023）。为探讨EPME在调控ERK/ULK1/NCOA4通路和增强铁蛋白自噬治疗HCC中的作用，采用分子对接测试EPME活性成分与通路靶点结合情况。结果显示其具有强结合亲和力，其中ULK1与大黄素结合能最高（12.2 kcal/mol），其次是ULK1与淫羊藿苷、NCOA4与大黄素以及GPX4与淫羊藿苷（均为11.1 kcal/mol）（图6，表6）。初步验证EPME可能通过调控ERK/ULK1/NCOA4通路治疗HCC。
淫羊藿苷、大黄素和黄芪苷可结合表皮生长因子受体（EGFR）的8个位点，如天冬酰胺-469（ASN-469）、半胱氨酸-207（CYS-207）和亮氨酸-445（LEG-445）；可结合细胞外信号调节激酶（ERK）的8个位点，如天冬氨酸-353（ASP-353）、天冬氨酸-123（ASP-123）和甲硫氨酸-125（MET-125）；可结合 UNC-51 类激酶 1（ULK1）的13个位点，如半胱氨酸-95（CYS-95）、赖氨酸-51（LYS-51）和丙氨酸-28（ALA-28）；可结合核受体辅激活因子4（NCOA4）的6个位点，包括缬氨酸-685（VAL-685）、亮氨酸-704（LEU-704）和半胱氨酸-669（CYS-669）；可结合p62的7个位点，包括精氨酸-9（ARG-9）、丝氨酸-13（SER-13）和天冬酰胺-37（ASN-37）。淫羊藿苷和黄芪苷与ULK1的结合位点均为谷氨酸-93（GLU-93）。淫羊藿苷、大黄素和黄芪苷与p62的结合位点均为精氨酸-9（ARG-9）。淫羊藿苷和黄芪苷与p62的结合位点均为精氨酸-9（ARG-9）、天冬氨酸-39（ASP-39）和丝氨酸-13（SER-13）。为证实用药促进铁自噬来治疗肝细胞癌（HCC），采用体外培养的人肝癌细胞系HepG2和淫羊藿多糖（EPME）联合自噬抑制剂 ULK1 进行后续验证。
7、EPME 对 HepG2 细胞增殖的抑制作用
由于中药的多成分特性，在体内的 HCC 实验中，根据分子对接结果，筛选出淫羊藿苷、大黄素和黄芪苷的前三位结合位点进行后续实验。CCK8 分析显示，与模型（HepG2）组相比，EPME、淫羊藿苷、大黄素和黄芪苷的剂量显著以浓度依赖性方式抑制细胞增殖（
p< 0.01）。EPME、淫羊藿苷、大黄素和黄芪苷的半数抑制浓度（IC50）分别为 2.443 mg/mL、276.10 μM、60.63 μM 和 114.9 μM（图 7A）。根据这些数据，我们选择了 EPME（2.5 mg/mL）、EPME + SBI-0206965（2.50 mg/mL + 10 μM）、淫羊藿苷（280.00 μM）、大黄素（62.00 μM）和黄芪苷（115.00 μM）进行后续实验。CCK8 检测结果显示，各给药组均能促进 HepG2 细胞在体外的死亡（
p< 0.01）。此外，在使用自噬抑制剂 SBI-0206965 处理后，EPME 未能促进 HepG2 细胞的死亡（
p< 0.01），并且与模型（HepG2）组相比无显著差异（
p> 0.05）（图 7B）。
EPME 在体外增强 HepG2 细胞的自噬反应
经 EPME 以及淫羊藿苷、大黄素、黄芪苷处理后，HepG2 细胞内的总铁和亚铁水平显著上升（
p< 0.01），活性氧（ROS）水平也呈现上升趋势（
p< 0.01），并且在电子显微镜下观察到 HepG2 细胞内自噬体数量显著增加。相比之下，在使用 EPME 联合 SBI-0206965 处理后，总铁、亚铁和 ROS 水平均显著低于 EPME 组（
p< 0.01），自噬体数量也显著减少，并且与模型（HepG2）组相比无显著差异（
p> 0.05）（图 7C-E）。为了进一步研究其作用机制，通过 Western blotting 检测了细胞中 ULK1、ERK1/2、NCOA4 和 GPX4 的水平及其磷酸化形式。
8、EPME 通过激活铁自噬在体外诱导 HepG2 细胞死亡
Western blotting 结果显示，EPME 的干预显著增加了 HepG2 细胞中 P-ULK1（ser317）和 NCOA4 的水平，同时降低了 GPX4 的水平（
P< 0.05，
p< 0.01）（图 8）。此外，使用 ULK1 抑制剂（SBI-0206965）进一步验证了 EPME 对 HepG2 信号通路的影响。结果显示，EPME 与 ULK1 抑制剂联合使用会降低 P-ULK1（ser317）和 NCOA4 的水平（
p< 0.05，
p< 0.01），增加 GPX4 的水平（
p< 0.05，
p< 0.01），最终抑制 HCC 细胞中铁蛋白的自噬。此外，发现 EPME + SBI-0206965 组与模型（HepG2）组在各蛋白水平上无显著差异（
p> 0.05），这进一步证明了 EPME 通过激活铁自噬在体外诱导 HepG2 细胞死亡。为了进一步探讨 EPME 诱导的细胞死亡中的自噬是否对 ERK 信号的反馈机制产生响应，我们进一步检测了各给药组中 P-ERK 的蛋白表达。结果显示，当 HepG2 细胞中的自噬加剧时，P-ERK 的水平明显受到抑制（
P< 0.05）；而 EPME 引发的自噬抑制则显著增加了 P-ERK 的水平（P < 0.05）。这些累积结果表明，EPME 诱导的细胞自噬反应对 ERK 信号通路产生了负反馈作用，从而导致 EPME 诱导的 HepG2 细胞死亡增加，这与 HCC 大鼠的体外实验数据一致。
9、MST 分析结果
测序和酶切验证了构建的 pCZN1-ULK1 重组表达质粒的准确性（图 9A）。在上清液和包涵体中均检测到了 ULK1 蛋白，且获得的 ULK1 蛋白纯度超过 85%（图 9B-D）。MST 分析显示，淫羊藿核心成分（淫羊藿苷、大黄素和黄芪苷）与核心靶点 ULK1 的结合亲和力随着复合物浓度的增加而增强，并伴有蛋白质迁移速率加快。拟合曲线呈现出倒置的“S”形，且具有明显的平台期，表明存在强的浓度依赖性特异性结合（图 9E-H）。ULK1 与这三种分子均显示出较高的亲和力（ULK1-淫羊藿苷 = 39.9 nM；ULK1-大黄素 = 45.8 µM；ULK1-黄芪苷 = 63.5 µM）。总之，分子对接结果证实这些成分与 ULK1 蛋白具有强结合能力（< 5 kcal/mol）。体外实验显示对肝细胞具有显著的抗肿瘤作用。结合 MST 实验，证实这些成分可结合 ULK1，调节 ERK/ULK1/NCOA4 介导的铁自噬反应，抑制肝肿瘤增殖，从而治疗肝癌。
肝细胞癌（HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位居世界第二。目前，手术切除仍是HCC的主要治疗方法；然而，对于晚期患者并非首选。因此，深入分析HCC的发病机制并寻求靶向治疗是亟待解决的关键问题之一。现有文献表明，HCC的发病机制主要与糖酵解、自噬和细胞免疫有关。然而，关于ERK/ULK1/NCOA4通路介导的铁自噬的研究尚未见报道。因此，深入研究铁自噬在HCC中的作用并寻找针对该通路的药物具有重要意义。
在本研究中，通过代谢组学与网络药理学分析，初步推测ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬抑制影响了HCC的发生发展。表皮生长因子受体（EGFR）位于细胞表面，存在于自噬体表面。SQSTM1/p62通过与LC3II相互作用后被包裹进入自噬体，在自噬体表面降解，是细胞自噬溶酶体酶降解过程的重要组成部分。NCOA4介导的铁蛋白自噬导致细胞内Fe2+氧化为Fe3+，并与去铁蛋白结合形成铁蛋白储存。其中，FTH1是铁蛋白壳的重要组成部分。NCOA4在铁噬过程中与铁蛋白结合并将其运送到溶酶体进行降解。当NCOA4耗竭导致铁蛋白降解丢失时，细胞内铁的生物利用度降低，细胞内铁离子水平升高，最终导致细胞铁毒性和死亡。GPX4是一种铁死亡保护蛋白，通过参与多种氧化还原反应，防止ROS积累并抑制细胞膜脂质过氧化。因此，抑制GPX4功能可加剧铁死亡。通过Western blotting实验进一步验证了ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬抑制与HCC的发生发展密切相关（图10）。
同时，为进一步探索通过调节ERK/ULK1/NCOA4治疗HCC的药物，采用淫羊藿（EPME）等提取物干预HCC大鼠。结果显示，EPME疗效显著，HCC大鼠死亡率显著降低，肝脏结节减少，生活条件和肝脏病理染色改善。EPME干预后，血清中甲胎蛋白（AFP）、谷氨酰转肽酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）、afu和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平显著下降。AFP是临床肝癌筛查的主要指标。肝脏癌变时，其血液水平显著升高。GGT、ALP、AFU和AST是临床评估肝功能的关键指标。这些酶主要存在于肝脏组织中，在健康人体内长期维持低水平。当肝细胞受损时，它们会释放到血液中，导致血液含量急剧增加。EPME可通过显著降低上述指标水平，减少肝细胞损伤和肝功能障碍。此外，与CTX相比，EPME提高了肝癌大鼠的存活率，并保护胸腺和脾脏系统免受损伤，更为显著。目前临床实践表明，使用单一化合物联合淫羊藿治疗晚期肝癌患者时，淫羊藿单独使用存在一定局限性；然而，与其他药物联合使用时，临床效果显著。
此外，血清代谢组学分析显示，EPME影响了HCC大鼠的差异代谢物，其中12种上调，28种下调。在造模后上调的差异代谢物中，MEA和PE破坏了甘油磷脂信号通路。它们都是细胞膜的重要组成部分，其水平升高使细胞膜更柔软、易碎，更容易增殖和分化，与EGFR/ERK信号通路密切相关。现代药理学研究已证明，药物口服后经胃肠道吸收进入血液循环，通过血液循环到达局部或全身组织以达到治疗疾病的目的。通过UPLC-Q-TOF-MS分析，EPME口服后共鉴定出27种有效生物活性成分。网络药理学临床靶点数据库显示，黄芪苷、大黄素、淫羊藿苷、山柰素-3-O-鼠李糖苷、新橙皮苷和山柰素-3-O-鼠李糖苷影响了核心靶点。此外，通路富集分析表明，MAPK中的EGFR/ERK通路富集，下游通路中的NCOA4介导的铁蛋白自噬通路被激活。在此基础上，通过Western blotting实验验证了EPME干预HCC大鼠的相关通路靶点，证实EPME抑制了ERK激活引起的ULK1/NCOA4激活，在HCC治疗中发挥作用。
为进一步探讨ERK/ULK1/NCOA4与EPME的关系，采用分子对接方法，结果显示EPME中的生物活性成分与ERK/ULK1/NCOA4信号通路的核心靶点具有良好的结合能。此外，淫羊藿苷和黄芪苷与ULK1的结合位点均为GLU-93，这两种化合物与p62的结合位点均为ARG-9、ASP-39、SER-13。这证明了淫羊藿通过多成分、多靶点、多空间协同作用实现肝癌治疗目标。此外，体外HCC模型显示，淫羊藿苷显著激活ULK1和NCOA4，抑制GPX4表达，导致自噬激活，细胞内铁蛋白形成增加，细胞内ROS含量升高，加剧细胞内铁含量过度死亡。大黄素显著增加NCOA4活性，增强铁自噬反应中铁蛋白的合成。黄芪苷显著抑制ERK活性，激活ULK1和NCOA4，在自噬反应中抑制mTOR活性，激活自噬反应，加剧肝癌铁自噬死亡过程（表7）。
现代药理学研究表明，黄芪苷具有抗炎、抗癌、抗氧化等作用。它显著抑制ERK1/2的磷酸化水平，增加癌细胞内ROS水平，促进癌细胞死亡。此外，黄芪苷在自噬途径中上调自噬流相关蛋白水平，增强自噬反应。大黄素通过MAPK/ERK途径抑制炎症诱导的血管生成并促进细胞凋亡。根据相关文献，大黄素激活ULK1信号通路并增强自噬。此外，大黄素介导的NCOA4铁蛋白自噬通路在结直肠癌中诱导铁死亡。根据现代研究，淫羊藿苷通过上调ULK1的磷酸化水平诱导自噬，并可加剧肝癌细胞的线粒体自噬，导致细胞死亡。由于中药的多成分特性，本研究在分子对接中筛选出结合能最高的生物活性成分。体外细胞实验验证了EPME通过抑制ERK和激活ULK1/NCOA4加剧HCC细胞的铁自噬。通过分子对接，结合能最高的靶点是自噬促进因子ULK1。因此，推测EPME的活性成分以ULK1为靶点激活铁自噬，使用ULK1自噬抑制剂SBI-0206965进行后续实验。
P-ULK1（ser317）是ULK1的一个位点，当ULK1在ser317处磷酸化时，ULK1复合体被激活，促进或启动自噬。作为ULK1自噬通路的抑制剂，SBI-0206965显著抑制了EPME诱导的HepG2细胞铁死亡。值得注意的是，淫羊藿苷、大黄素、黄芪苷和EPME均增强了HepG2细胞的铁死亡。铁自噬检测结果显示，HepG2细胞中总铁、亚铁和ROS水平在各给药组中均有所提高。此外，Western blotting实验显示，各给药组P-ULK1（ser317）和NCOA4水平显著升高，而GPX4水平显著降低。此外，EPME联合ULK1自噬抑制剂SBI-0206965显著抑制了HepG2细胞的铁自噬反应。进一步考察ULK1激活或抑制对上游ERK通路的影响。根据Western blotting结果，EPME诱导的细胞自噬反应对ERK信号通路产生了负反馈作用，加剧了EPME诱导的HepG2细胞铁死亡。Western blotting结果还表明，EPME比单独给药更有效。此外，MST实验确认EPME的核心成分（淫羊藿苷、大黄素和黄芪苷）与核心靶点ULK1具有很强的结合亲和力。
上述结果表明，ERK/1ULK/NCOA4介导的铁自噬抑制是肝细胞癌（HCC）的一种新致病机制。此外，淫羊藿提取物（EPME）中的生物活性成分，如淫羊藿素、大黄素和木兰花碱等，能够穿透细胞膜，并与细胞内的蛋白质（如表皮生长因子受体（EGFR）、 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因（KRAS）、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、ULK1和NCOA4）发生共价结合，从而抑制ERK及其下游信号通路。这种抑制作用激活了细胞内ULK1/NCOA4介导的铁蛋白自噬，有助于HCC的治疗。此外，EPME通过多组分、多靶点、多部位的作用机制在HCC治疗中发挥协同作用。此外，本研究设置了EPME的低、中、高剂量给药组，主要研究不同剂量与治疗效果之间的关系，并探讨机制调控趋势。最大给药剂量为成人临床等效剂量的9倍。值得注意的是，关于EPME长期毒性的报告表明，即使在高达临床等效剂量160倍的剂量下也无毒性，从而支持了EPME的安全性。此外，淫羊藿与单体化合物联合使用已在临床实践中用于HCC的治疗，与单独使用抗癌单体化合物相比，显示出更优越的治疗效果。在未来的研究中，我们打算通过使用类器官药理学模型，进一步优化EPME和其他单体化合物的临床联合治疗剂量。我们的目标是阐明针对不同HCC患者的最优用药比例、剂量和临床治疗方案。这种方法有望提高临床治疗效果，减少对其他化疗药物的耐药性，提高患者的生活质量，并为淫羊藿在HCC辅助治疗中的开发和利用提供坚实的基础。
总之，本研究结合代谢组学和网络药理学方法，以及动物和细胞实验，证明了ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬抑制是HCC发生的一种新机制。同时证实，EPME中的生物活性成分如淫羊藿素、大黄素和木兰花碱等通过靶向抑制ERK，激活ULK1/NCOA4，加剧HCC细胞的自噬，从而在HCC治疗中发挥作用。值得注意的是，EPME通过多组分、多靶点多、部位的机制对HCC治疗发挥协同作用。因此，我们的研究为进一步探索HCC的致病机制和开发HCC治疗的靶向药物提供了基础。
【结论】
本研究结合代谢组学、网络药理学方法以及动物和细胞实验，证实了ERK/ULK1/NCOA4介导的铁自噬抑制是HCC发生发展的新机制。同时确认淫羊藿提取物（EPME）中的淫羊藿苷、大黄素和黄芪苷等生物活性成分可通过靶向抑制ERK，激活ULK1/NCOA4，加剧HCC细胞自噬，从而发挥治疗HCC的作用。特别值得一提的是，EPME通过多成分、多靶点、多部位机制对HCC治疗产生协同作用。因此，本研究为深入探索HCC的发病机制及开发HCC靶向药物提供了基础。
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