叶邦策等人改造解脂耶氏酵母，实现淫羊藿素高效生产

在传统中药里，淫羊藿是一味常见且重要的药材。从淫羊藿属植物中提取的黄酮类化合物淫羊藿素（ICT），具有广泛的药理活性，包括抗炎、抗骨质疏松、心血管保护以及抗肿瘤等作用，尤其是对于晚期肝癌，它的疗效已经通过了多期临床试验的验证，成为了国际认可的治疗药物。

但 ICT 的获取并不容易，传统的从植物中提取的方式，面临着野生淫羊藿资源过度开采、生长缓慢、繁殖困难以及植株中 ICT 含量低等问题，导致提取成本高、产量低，而化学合成方法也有合成步骤复杂以及环境污染等弊端，合成生物学的兴起为解决这一问题提供了新思路。

近日，华东理工大学叶邦策、刘卫兵团队在 ACS Synthetic Biology 上发表了一篇题为“Metabolic Engineering of Yarrowia lipolytica for Enhanced De Novo Biosynthesis of Icaritin”的研究，研究团队通过代谢工程改造解脂耶氏酵母，实现了淫羊藿素（ICT）的从头生物合成，为其大规模工业化生产奠定了基础。

此前，科研人员曾尝试用酿酒酵母和大肠杆菌来合成 ICT，虽然取得了一定成果，产量却仅有 19.7 mg/L，且两种微生物共同培养时还存在代谢负

担、能量和前体供应不足以及共生关系不稳定等问题。解脂耶氏酵母具有独特的优势：对高渗透压和低 pH 值有很强的耐受性，能在工业生产中有效防止其他微生物污染；被认为是“一般认为安全”（GRAS）的酵母，适合用于合成食品和药品；其细胞内的乙酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A 通量高，为合成 ICT 提供了充足的前体物质；并且拥有成熟的基因编辑工具，便于进行基因工程改造。因此，科研团队利用解脂耶氏酵母为底盘，构建了能够从头合成淫羊藿素的微生物细胞工厂。

淫羊藿素的生物合成主要分为两步：从山柰酚（KAE）到 8-异戊烯基山柰酚（8P-KAE）：需引入异戊烯基转移酶（EsPT），并以二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）为异戊烯基供体；从 8P-KAE 到淫羊藿素（ICT）：需引入 O-甲基转移酶（OsOMTm），以 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体。

此前团队曾对解脂耶氏酵母进行代谢工程改造，构建了合成山柰酚（KAE）的代谢途径。研究人员在此基础上中进一步筛选出来自淫羊藿的异戊烯基转移酶（EsPT）和来自水稻的 O-甲基转移酶（OsOMTm），并将它们的基因进行密码子优化，导入解脂耶氏酵母中，最终成功构建了从山奈酚合成 ICT 的工程菌株。不过此时工程菌株的产量较低，只有 0.75mg/L，因此研究团队通过以下多种策略进行了优化。

为了提高 EsPT 的催化活性，研究人员利用人工智能预测了 EsPT 的蛋白质结构，并对其信号肽进行截断优化。结果显示，截断到第 36 个氨基酸时效果最佳，ICT 产量提升到了 5.1mg/L，是对照组的近 7 倍。之后，他们又通过增加 tEsPT 和 OsOMTm 这两个关键酶基因的拷贝数，进一步提高了ICT 的产量。在 2 和 3 个拷贝数下，菌株 Yl-ict03 和 Yl-ict04 产生的 ICT 滴度分别为 10.38 和 24.5 mg/L。

图 | AI 预测的 EsPT 蛋白三维结构及不同截断位点，以及 EsPT 截断至不同位置的菌株发酵数据

tEsPT 利用异戊烯基供体 DMAPP 催化 KAE 的 C8 异戊烯化，从而形成 8P-KAE。DMAPP 在酵母细胞中通过 MVA 途径合成。通过对酵母的 MVA 途径进行改造，过表达限速酶 HMGR 和 IDI1 等基因以提高 DMAPP 产量。改造后的菌株 Yl-ict06 的 ICT 产量提升到 112.3mg/L，8P-KAE 产量更是大幅增加。随着对 MVA 途径的进一步优化，引入更多相关基因，ICT 产量持续上升，在菌株 Yl-ict09 中达到 171.6mg/L。

此外，科研人员优化了氧气供应和葡萄糖利用，通过引入 Vitreoscilla 血红蛋白（VHb）改善氧气运输以及过表达己糖激酶（HXK）加速葡萄糖摄取和转化，使得 ICT 产量进一步提高，在菌株 Yl-ict12 中达到 188 mg/L。

O-甲基转移酶 OsOMTm 的活性会因产物 S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的积累而受抑制。为了降低 SAH 的反馈抑制，研究团队过表达了 SAH 水解酶（SAH1）和腺苷激酶（ADO1），促进 SAH 分解。

最终，通过多种优化策略改造后的工程菌株 Yl-ict15，其 ICT 产量达到了 247.02 mg/L，这项研究既是首次在解脂耶氏酵母中实现淫羊藿素的从头合成，也是目前报道的微生物合成淫羊藿素的最高产量，比之前的记录高出 11.7 倍。可以看到，合成生物学正在重塑传统药物的生产方式和生产效率，为其他黄酮类植物天然产物的生物合成改造提供了宝贵的借鉴经验。

参考文献：

1.https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acssynbio.4c00754

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