湖北
分享至
一、样品制备：从源头把控质量
- 蛋白裂解效率
- 判断依据：裂解后液体应澄清无沉淀，离心后沉淀量＜5%。
- 问题解决：若沉淀过多，需增加裂解液浓度（如RIPA+1% SDS）或延长超声时间。
- 蛋白定量准确性
- 关键操作：使用BCA法或Bradford法，OD值需在标准曲线线性范围内（建议稀释样本至0.2-2 mg/mL）。
- 避坑提示：避免高浓度SDS或DTT干扰，可透析或稀释后检测。
- 凝胶浓度选择
- 低分子量蛋白（＜30 kDa）选12%-15%分离胶；大分子（＞100 kDa）用8%-10%胶。
- 异常条带：若出现“微笑条带”（边缘扩散），可能电压过高（建议恒压80-100 V）。
- Marker对照
- 预染Marker应清晰分层，若条带模糊或断裂，需更换新鲜电泳缓冲液（Tris-Glycine pH 8.3）。
- 转膜验证
- 湿转法（＞50 kDa蛋白）用250 mA 90分钟；半干转（小蛋白）25 V 7分钟。
- 检测方法：转膜后用丽春红染色观察，若Marker未完全转移需延长转膜时间。
- 膜的选择
- PVDF膜需甲醇激活（10秒），硝酸纤维素膜（NC膜）直接使用，避免触碰导致膜破损。
- 封闭充分性
- 5%脱脂牛奶（磷酸化蛋白用BSA）封闭1小时，若背景高可延长至2小时或提高浓度至7%。
- 一抗稀释优化
- 初试建议1:500-1:2000稀释，阳性对照无信号时优先调整一抗浓度而非直接更换抗体。
- 二抗交叉污染
- 不同宿主来源的一抗需使用对应二抗（如兔源一抗+HRP标记抗兔二抗），孵育后严格洗膜3×10分钟。
- 曝光时间控制
- ECL化学发光法先试短曝光（10秒），避免过曝；弱信号可累计曝光至5分钟。
- 条带异常解析
- 无信号：检查抗体效期、二抗是否失活（可用β-actin复检）；
- 非特异性条带：增加封闭时间或添加1% Triton X-100洗膜。
实验卡在抗体环节？博研生物推出WB专项抗体套装：
666元享6支抗体组合（3支一抗20μL + 3支二抗100μL）
特别声明：以上内容(如有图片或视频亦包括在内)为自媒体平台“网易号”用户上传并发布，本平台仅提供信息存储服务。
Notice: The content above (including the pictures and videos if any) is uploaded and posted by a user of NetEase Hao, which is a social media platform and only provides information storage services.
