Nature子刊：陈斯迪团队开发多种Cas12a 敲入小鼠模型，用于多重基因组编辑、疾病建模和免疫细胞工程

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

基因编辑技术的兴起，尤其是 Cas9 敲入小鼠的开发，显著加速了遗传学、基因组学、免疫学和癌症等多个领域的功能发现。然而，人类疾病的基因多效性和基因相互作用网络的复杂性需要一种能够同时进行多重基因编辑的敲入小鼠模型。

2025 年 3 月 20 日，耶鲁大学陈斯迪课题组在Nature Biomedical Engineering期刊发表了题为：Cas12a knock-in mice for multiplexed genome editing, disease modelling and immune cell engineering 的研究论文。

该研究开发出多种 Cas12a 敲入小鼠模型，助力针对复杂基因互作网络，疾病建模与免疫遗传学的研究。

在这项最新研究中，陈斯迪教授团队开发了一系列背景为 C57BL/6 的 Cre 依赖的条件性表达小鼠或组成性表达 Cas12a 小鼠模型，包括 LbCas12a 和高保真增强版 AsCas12a（enAsCas12a-HF1）。

研究团队首先通过与 CMV-Cre 小鼠交配获得了组成性表达 Cas12a 蛋白的小鼠，验证了 Cas12a 蛋白的表达及在不同主要器官中的表达量，并通过全鼠表型分析证实 Cas12a 的组成性表达并未导致与 C57BL/6 背景品系相比的任何可辨别的病理差异。通过使用 LbCas12a 和 enAsCas12a 小鼠原代免疫细胞，他们在 T 细胞和骨髓来源的树突状细胞（BMDC）中实现了高效的双基因编辑（Double Knockout）。高通量测序结果显示，使用 enAsCas12a 小鼠系统可以在这些细胞类型中实现高达 90% 的基因编辑效率。

为了验证 Cas12a 敲入小鼠在体内基因编辑中的应用，研究团队使用 LNP 系统将靶向 Ttr 基因的CRISPR RNA（crRNA）递送到组成性表达 enAsCas12a 的小鼠体内。实验结果显示，注射后 6 天，血清中 TTR 蛋白水平显著下降，并在 20 天内保持稳定。这表明，LNP-crRNA 系统在体内具有高效的基因靶向能力。

为了进一步验证 Cas12a 敲入小鼠优越的的体内基因编辑效率及在癌症建模中的应用，研究团队设计了一个包含四个肿瘤抑制基因（Trp53、Pten、Apc和Rb1）的 AAV-crTSG 表达阵列，并通过 AAV 系统递送到条件性表达 enAsCas12a 小鼠体内。结果显示，注射后一个月内，所有注射 AAV-crTSG 的小鼠均在头颈部位形成了侵袭性肿瘤，而对照组小鼠（注射AAV-vector）未观察到肿瘤形成。组织学分析显示，这些肿瘤具有典型的鳞状细胞癌特征，并且肿瘤细胞中表达 enAsCas12a-HF1-GFP 蛋白，表明肿瘤的形成是由 AAV-crTSG 介导的基因编辑引起的。

为了实现同步基因激活和敲除，研究团队将 LSL-enAsCas12a-HF1 小鼠与 dCas9-SPH 转基因小鼠交配，生成了 LSL-enAsCas12a-HF1；dCas9-SPH 双转基因小鼠。双转基因老鼠及配合设计的一个包含 Cas9-sgRNA 和 Cas12a-crRNA 的融合引导 RNA 系统，研究团队建立了一个同时进行双基因激活和敲除（DAKO）的系统。DAKO 系统的有效性在 BMDC 细胞实验中得到验证，流式分析实验结果显示，DAKO 系统在单个细胞水平上同时实现双基因激活和敲除，为研究复杂基因相互作用网络提供了强大的工具。

Cas12a 敲入小鼠的开发为多重基因编辑、疾病建模和免疫遗传学研究提供了一个强大的平台。这些小鼠品系及其伴随的病毒和非病毒递送载体，共同构成了一个广泛适用的工具包，能够应用于基因编辑、免疫细胞工程、免疫学发现和复杂基因相互作用的解卷积。随着递送载体的优化及靶点组合的精确设计，Cas12a 敲入小鼠有望在临床治疗中发挥重要作用，不仅应用于肿瘤治疗，还可扩展至其他疾病领域，为精准个性化治疗和通用治疗铺平道路。

该研究由耶鲁大学陈斯迪教授课题组主导完成，耶鲁大学博士学生唐开元和周立群为该论文的共同第一作者。陈斯迪教授、约翰·霍普金斯医学院Matthew Dong，以及即将成为威斯塔研究所（The Wistar Institute）独立PI的周小宇博士为该论文的共同通讯作者。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41551-025-01371-2