NeuroExplorer数据分析软件小鼠视觉皮层中间神经元轴突形态

新皮层中间神经元在形态和生理上具有很大的可变性，尽管它们的确切作用仍未完全明确，但它们在控制神经回路动态方面处于理想位置。为了更好地理解这种多样性，我们对3种视觉皮层中间神经元亚型进行了详细的解剖学和生理学特征分析。这些中间神经元分离自转基因小鼠，在生长抑素、小白蛋白和神经肽Y阳性神经元中表达绿色荧光蛋白。我们发现，这3组中间神经元在树突和轴突形态上存在系统性差异，并且在它们接收的自发兴奋性和抑制性突触电流的频率、幅度和动力学方面也有显著差异。此外，我们检测到它们的突触输入动力学与轴突分支的定量特征之间存在相关性。这表明不同类型的中间神经元可能传递不同的活动时间模式。我们的研究结果还证实了轴突形态在中间神经元分类中的重要性。

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一、引言

虽然 γ- 氨基丁酸（GABA）能中间神经元在新皮层神经元中占少数，但它们却导致了皮层在形态、电生理和神经化学方面的高度异质性。这种丰富的多样性表明，皮层回路中的抑制性成分在网络计算中起着关键作用。

由于皮层中间神经元具有令人瞩目的多参数多样性，对其进行特征描述一直是一项重大挑战。为了理解中间神经元的功能，有必要识别中间神经元，并确定它们是否属于特定类别。这并非是一项学术性练习，因为就像在视网膜中一样，每一类神经元都可能执行独特的回路功能。尽管近年来取得了进展，但事实证明，为这些细胞制定一个有意义的分类方案仍然很困难。有观点认为，中间神经元无法进行有意义的分类，因为它们在解剖学和生理学上的多样性可能代表着一个连续体 。按照高尔基解剖学家的传统，其他研究小组基于形态学或生理学参数提出了不同的中间神经元分类方法 。然而，我们距离一个被普遍接受的中间神经元分类法仍相距甚远，这个问题仍然悬而未决。

许多中间神经元分类都集中在其形态或输出的各个方面（即它们的放电模式以及在靶细胞上产生的突触后电位），而有研究发现海马中间神经元的形态与突触输入动力学之间存在着有趣的相关性。为了探究这些发现是否也适用于新皮层，我们使用聚类分析来研究新皮层中间神经元的形态与输入（即它们接收的突触后电流 [PSCs]）之间的相关性。为了进行这项研究，我们利用了越来越多的绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠品系，这些品系标记了表达特定标记物（如小白蛋白 [PV]、神经肽 Y [NPY] 和生长抑素 [SOM]）的同质中间神经元群体。我们从这些动物的视觉皮层制备脑切片，并对荧光标记的细胞进行靶向全细胞记录，以记录它们的突触电流，同时用生物胞素填充细胞，以便事后重建其形态。我们的定量分析支持存在不同的中间神经元簇。我们发现，PV、NPY 和 SOM 标记的中间神经元在神经化学成分、形态以及兴奋性突触后电位或抑制性突触后电位之间存在高度相关性，其中令人惊讶的是，这种相关性特别源于轴突形态。轴突形态与细胞接收的 PSCs 动力学之间的相关性非常显著，这表明存在一个高度有序的网络，具有突触前和突触后成分的特异性。我们的研究结果为不同的中间神经元回路如何在时间上控制锥体细胞树突分支的不同部分，以及如何在网络节律的不同阶段发挥作用，提供了一种潜在的机制。

二、材料和方法

01. 实验动物

SOM 小鼠来自原始的白化品系，而 PV 和 NPY 小鼠则源自 C57/Bl6 小鼠。用野生型 C57/Bl6 小鼠进行回交。对于 PV 小鼠，从相关文库中鉴定出含有小鼠小白蛋白（Pv）基因的细菌人工染色体（BAC）克隆。使用一个包含整个 Pv 基因以及 140kb 上游和 30kb 下游区域的 BAC 克隆进行 BAC 修饰。将含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）cDNA 和磷酸甘油酸激酶聚腺苷酸序列的 DNA 片段插入到 PV 基因的翻译起始密码子处。通过常规方法注射环状 BAC DNA 以生成 BAC 转基因小鼠。在本研究中使用的转基因品系 B13 中，EGFP 选择性地在新皮层（包括视觉皮层）约 50% 的 Pv 阳性中间神经元中表达。EGFP 表达的发育时间进程与通过免疫染色检测的 Pv 表达相似。详细的实验步骤和特征描述将在其他地方发表。

02. 电生理学

根据相关指导方针，从出生后 14 至 23 天的小鼠制备急性冠状位视觉皮层切片。大多数动物为出生后 15 - 16 天，不同年龄之间未发现明显差异。用含有氯胺酮和赛拉嗪的混合物对动物进行麻醉。断头后，迅速取出大脑并放入冰冷的切片溶液中，该溶液含有（以毫摩尔计）：3KCl、1.5NaH₂PO₄、27NaHCO₃、222 蔗糖、1CaCl₂、4MgSO₄，用 95% O₂ - 5% CO₂饱和至 pH7.4。将大脑冷却至少 2 分钟，然后用振动切片机切出 300μm 的视觉皮层切片。随后将切片置于室温的人工脑脊液（ACSF）中，该溶液含有（以毫摩尔计）：126NaCl、3KCl、1.1NaH₂PO₄、26NaHCO₃、1 葡萄糖、2CaCl₂、1MgSO₄，用 95% O₂ - 5% CO₂饱和至 pH7.4。1 小时后，将切片逐个转移到保持在 30 - 33°C 的记录室中，并持续用充氧的 ACSF 灌注。

通过荧光成像观察到的胞体 GFP 荧光，识别所有观察到中间神经元的层（除了第一层）中的中间神经元。然后使用直立式显微镜的微分干涉差（DIC）光学系统观察所需的细胞。使用电阻在 6 - 10MΩ 之间的电极和内部溶液（含有以毫摩尔计：135Cs - 葡萄糖酸盐、10MgCl₂、0.1CaCl₂、1 乙二醇四乙酸、10 4 - （2 - 羟乙基） - 1 - 哌嗪乙磺酸、0.4% 生物胞素，pH7.25）进行全细胞电压钳记录。在 - 60mV、+10mV 或两者条件下记录 52 个细胞（19 个 PV、20 个 NPY、13 个 SOM）的自发活动。在 - 60mV 时的内向电流被确定为由 α - 氨基 - 3 - 羟基 - 5 - 甲基 - 4 - 异恶唑丙酸（AMPA）和 / 或红藻氨酸引起，因为它们可被 12.5μM 的 6 - 氰基 - 7 - 硝基喹喔啉 - 2,3 - 二酮（CNQX）完全消除，而外向电流被确定为由 GABA 引起，因为它们可被 100μM 的印防己毒素消除。对于一部分细胞（5 个 PV、6 个 NPY、6 个 SOM），在记录自发活动后加入 1mM 河豚毒素（TTX）。在 - 60mV 和 + 10mV 下记录微小活动。

信号输入到放大器，并使用相关软件在 PC 上记录，或者输入到另一款放大器，并使用相应软件在 MacIntosh 上记录。接入电阻约为 10MΩ，在记录过程中其变化不允许超过 20%。

03. 电生理学分析

所有生理数据均使用 MiniAnalysis 5.6（Synaptosoft 公司，美国佐治亚州迪凯特市）进行分析。对于每种情况（自发和微小兴奋性突触后电流 [EPSCs] 以及抑制性突触后电流 [IPSCs]），手动检测至少 300 个事件，使用高于噪声 2rpm 的阈值进行数字平均（噪声范围在 1 - 3rpm 之间）。测量每个数字平均的幅度、10 - 90% 上升时间和单指数衰减时间常数（taus）。通过将检测到的事件数除以事件发生的持续时间来确定频率。

04. 形态学重建

切片按照特定方法进行处理。电生理记录后，立即将切片置于 4% 多聚甲醛的 0.12M 磷酸盐缓冲液（PB）中，并在 4°C 下保存过夜。然后将切片在 20% 蔗糖的 0.12M PB 中进行冷冻保护 2 - 8 小时，在干冰上用阻织冷冻介质冷冻。

解冻后，将切片在 0.12M PB 中冲洗 3 次，并在室温下搅拌的条件下，用 0.12M PB 中的 1% 过氧化氢预处理 30 分钟。然后将组织在 0.02M 磷酸钾生理盐水（KPBS）中冲洗，在抗生物素蛋白 - 生物素 - 过氧化物酶复合物中室温搅拌孵育过夜（每 1ml 0.02M KPBS 和 0.3% Triton - X 中加入 10μl 溶液 A 和 10μl 溶液 B）。

切片在 0.02M KPBS 中冲洗 3 次，并在 0.02M KPBS 中含有 0.7mg/ml 3,3'- 二氨基联苯胺、0.2mg/ml 尿素过氧化氢、0.06M Tris 缓冲液的溶液中孵育 5 - 15 分钟。3,3'- 二氨基联苯胺反应完成后，将切片在 0.02M KPBS 中冲洗，并安装在 Vectashield 封片剂中。使用倒置显微镜的 DIC 光学系统观察染色细胞，并使用 Neurolucida 工作站对 18 个神经元（6 个 PV、7 个 NPY、5 个 SOM）进行三维追踪。所有绘图均在 60×1.40 数值孔径物镜下进行，并结合显微镜额外的 31.5 倍放大倍数。

05. 形态学变量

使用 NeuroExplorer 的分析工具，并结合 Excel 和 MatLab 进一步分析，对绘制的神经元在 98 个形态学参数上进行评分。我们没有对所选参数进行区分，而是试图在程序允许的范围内尽可能深入地描述每个细胞。这些变量描述了胞体、树突、轴突以及树突和轴突分支之间的关系（见补充表 1）。然后进行互相关矩阵分析，与一个或多个其他变量相关性超过 80%（P<0.05）的变量被剔除，但逻辑上不相关参数之间的相关性情况除外（例如，当一个树突参数与一个轴突参数相关时）。最终保留了 61 个变量。

06. 聚类分析和主成分分析

分别使用 Statistica 算法（沃德法，欧几里得距离）对形态学和生理学数据进行聚类分析。为了提取对聚类起主要作用的变量，对相同数据使用主成分分析（PCA）方法进行因子分析。提取与第一个因子相关性超过 70% 的变量，得到 9 个形态学和 4 个生理学参数。对合并的形态学和生理学数据也进行 PCA 分析，得到 8 个形态学和 4 个生理学参数与第一个因子相关性超过 70%。所有单个参数与未合并数据中的参数相同，只是合并数据中没有 “树突数量” 这一参数。

三、结果

使用了三种 GFP 转基因小鼠品系，标记了三种不同的中间神经元群体：小白蛋白（PV，详见方法部分）、神经肽 Y（NPY）和生长抑素（SOM ）。在所有三种品系中，GFP 标记的神经元都可以通过初级视觉皮层的落射荧光观察到。对神经元进行全细胞记录，并在电压钳下、细胞内存在铯的条件下记录自发和微小的突触后电流（PSCs，详见方法部分）。用生物胞素填充细胞，以便事后进行形态学鉴定（见图 1）。

图1. PV、NPY和SOM中间神经元的解剖学和生理学特征。在记录过程中向神经元注入生物素，事后识别并进行三维重建。上图：这里展示了每组中来自第II层中间神经元的代表性示例。胞体和树突用黑色表示，而轴突则用不同颜色编码：PV轴突为绿色，NPY轴突为红色，SOM轴突为蓝色。所有图表都将保持这种配色方案。左侧的竖线标记了层边界。下图：展示了每组在-60mV和+10mV下的代表性电压钳记录。兴奋性突触后电流（EPSCs）和抑制性突触后电流（IPSCs）的比例尺为15pA和20ms。每组还展示了代表性的放电模式。每条曲线的比例尺为10mV和100ms。

01. 神经化学鉴定的中间神经元之间的形态学差异

我们试图根据多维形态学分析对数据库进行分类。为此，对 18 个细胞（6 个 PV、7 个 NPY、5 个 SOM ）进行了三维重建。对于每个神经元，测量了 98 个形态学变量，这些变量描述了它们的位置、胞体、树突和轴突的形态计量学特性，以及树突和轴突分支之间的关系（见补充表 1）。为了去除冗余，在进行互相关矩阵分析后，剔除了与一个或多个其他变量相关性超过 80%（P<0.05）的变量。最终保留了 61 个相互之间相关性明显较低的变量。

使用这 61 个变量进行聚类分析（图 2；沃德法，欧几里得距离）。所有细胞根据其神经化学成分分别聚成 3 个簇，只有 1 个 NPY 细胞与 PV 组聚在一起。尽管 PV 和 NPY 细胞之间的最大连锁差异超过 30%，但它们似乎属于同一超家族，并且与 SOM 细胞的连锁距离几乎相等。

图2. 形态学聚类分析。(A) 代表18个重建中间神经元的61个变量的聚类分析树。每个分支根据其所代表的细胞类型进行颜色编码。(B) 参与聚类分析的中间神经元的三维重建图。神经元按照它们在聚类分析树中出现的顺序排列。胞体和树突以黑色显示，而轴突则根据所属组别以不同颜色显示。神经元根据其在皮层中的层次位置垂直排列。层边界用竖线标记。比例尺：100μm。

这些数据表明，三种经神经化学方法鉴定的新皮层中间神经元群体在形态上存在系统性差异。

02. 不同类型中间神经元之间的突触输入差异

通过计算自发兴奋性突触后电流（EPSCs）和抑制性突触后电流（IPSCs）的频率、幅度、起始和终止动力学的平均值来表征每个细胞的突触输入。在 GABA 能电流的反转电位（-60mV）下，以电压钳记录自发 EPSCs；它们由 α- 氨基 - 3 - 羟基 - 5 - 甲基 - 4 - 异恶唑丙酸（AMPA）/ 红藻氨酸受体介导，因为 12.5μM 的 6 - 氰基 - 7 - 硝基喹喔啉 - 2,3 - 二酮（CNQX）可将其完全消除。在谷氨酸能事件的反转电位（+10mV）下记录自发 IPSCs，它们确实由 GABA 受体介导，因为 100μM 的印防己毒素可阻断它们（图 1）。对于每个细胞，大约对 300 个 EPSCs 和 IPSCs 进行数字平均，并对每个 EPSC 和 IPSC 平均值测量 10-90% 上升时间和幅度。为了便于比较，将所有数字平均的衰减时间拟合为单指数时间常数（taus）。

对 39 个细胞（14 个 PV、14 个 NPY、11 个 SOM ）评估了上述 8 个参数，并用于生理聚类分析（图 3）。除了 2 个 PV 细胞与 NPY 组聚在一起外，突触输入参数也将三种神经化学鉴定的新皮层中间神经元群体区分开来，产生了与形态学参数相同的分类结果。有趣的是，生理聚类不仅根据细胞的神经化学成分将细胞分开，而且还保留了各组之间的基本关系，表明 PV 和 NPY 细胞属于同一超家族，并且与 SOM 细胞的个体距离相等。

图3. 生理学聚类分析。(A) 描述39个细胞（14个PV、14个NPY和11个SOM）自发突触后电流（PSCs）的8个变量的聚类分析树。重建的18个细胞以较深颜色和彩色细胞名称表示。(B) 按照聚类分析树中的顺序，每个重建神经元的兴奋性突触后电流（EPSC）和抑制性突触后电流（IPSC）平均值。每个平均值由约300个自发PSCs组成。比例尺：IPSC平均值为2pA和60ms；EPSC平均值为2pA和15ms。(C) 聚类分析中使用的8个变量的汇总数据，表示为每个细胞组的平均值。通过t检验评估统计学意义；*P<0.05 ，**P<0.01。(D) 描述部分细胞（5个PV、6个NPY和6个SOM）微小PSCs的8个变量的聚类分析树。

03. 不同类型中间神经元之间微小电位的差异

我们研究了使用自发 PSCs 进行的分类是否也适用于微小事件。在正常条件下记录后，对 5 个 PV、6 个 NPY 和 6 个 SOM 细胞浴应用 1μM 河豚毒素（TTX）。以与记录自发活动相同的方式获得微小 EPSCs 和 IPSCs 的上升时间、衰减时间常数、幅度和频率。对 17 个细胞的 8 个新参数进行聚类分析，得到的树形图与使用自发 PSCs 得到的相似（图 3D），亚组根据其神经化学成分划分，1 个 PV 细胞与 NPY 组聚在一起，PV 和 NPY 细胞属于同一超家族。

04. 仅轴突形态就能预测中间神经元细胞类别

为了研究哪些形态学变量是给定细胞中突触输入生理学的最重要预测指标，我们将 61 个形态学变量分为 3 个子组 —— 胞体、树突和轴突，并进行了 3 次独立的聚类分析。描述树突和轴突分支之间关系的 2 个变量同时包含在树突和轴突子组中。

我们发现，胞体形态对细胞类别的预测能力很差，而树突和轴突形态都能够将细胞分为神经化学预测的组（图 4）。然而，仅基于轴突形态的分析能够保持各家族之间的相对距离，而基于树突分支特性的聚类将 PV 细胞与 SOM 细胞归为同一超家族。我们得出结论，轴突形态计量学特征是中间神经元家族最强的形态学预测指标。

图4. 胞体、树突和轴突形态的聚类分析。(A) 仅使用描述胞体大小、形状和位置的4个变量对18个重建细胞进行聚类分析的树形图。(B) 仅使用与树突相关的25个变量（包括2个描述树突与轴突关系的变量）对18个重建神经元进行聚类分析的树形图。(C) 仅使用与轴突相关的34个变量（包括2个描述轴突与树突关系的变量）对18个重建神经元进行聚类分析的树形图。

05. 中间神经元类别的形态学预测指标

我们的结果表明，形态学变量和生理学变量一定是这三种中间神经元类别的特征，因为它们分别独立地导致了相似的细胞聚类。我们进一步确定了导致聚类的单个形态学参数。为了识别这些关键变量，我们分别对形态学和生理学变量以及它们的组合进行了使用主成分分析（PCA）的因子分析。然后提取了所有与第一个主成分相关性超过 70% 的变量（见方法部分）。这得到了 9 个形态学和 4 个生理学参数。然后计算这些变量的相关矩阵，以确定形态学和生理学之间的确切关系（见表 1）。从这个矩阵中，对得分最高的变量针对三组中间神经元进行了更仔细的表征。

06. 从胞体到瓦片质心的距离

为了描述树突和轴突分支，我们对神经元的二维投影进行了平铺分析。因此，这种平铺是在切片的冠状平面上任意进行的，在进行依赖于平铺的拓扑分析时，应记住这一事实，它可能是一个限制因素。在每个细胞上绘制两个瓦片，分别包围树突和轴突（图 6）。为每个瓦片计算了几个参数（见补充表 1），包括重心，即 “瓦片质心”，通过其与胞体重心的距离来定义。有趣的是，树突和轴突瓦片质心都成为了每种细胞类别的重要形态学预测指标。图 5 展示了每种细胞类型的这两个变量的示意图。SOM 细胞的轴突和树突分支最为不对称，而 NPY 细胞的突起分布最为均匀。

图5. 树突和轴突瓦片质心到胞体的距离。使用NeuroExplorer确定轴突和树突的瓦片质心位置。计算组平均值并用于图表展示。采用t检验评估统计学意义；*表示P<0.05 ，**表示P<0.01。

直观地说，这种不对称性可能与细胞突起的总长度或瓦片面积有关，因为更长的突起和更大的表面积会使最终质心的精确位置有更大的变化性。然而，对总凸起长度、瓦片面积和瓦片质心之间关系的研究表明，它们之间几乎没有或没有相关性。汇总数据显示，树突质心到胞体的距离与树突总长度呈 21% 的负相关，与树突瓦片面积呈 8% 的负相关，而轴突质心的位置与轴突总长度呈 28% 的负相关，与轴突瓦片面积呈 40% 的正相关。因此，我们得出结论，树突和轴突瓦片质心的位置是独立的形态学特征，可能源于调节细胞整体外观的发育因素，而不是其他参数（如突起长度和瓦片面积）的附带现象。

07. 轴突的分形维数

分形维数是另一种平铺分析方法，用于测量一维轴突填充二维空间的能力。分数接近 1 意味着轴突对空间的填充较差，而分数接近 2 则意味着轴突几乎完全填充了空间（图 6A）。PV 细胞的轴突几乎完全填充了它们的瓦片，而 SOM 细胞的轴突则使瓦片的很大一部分为空。具体而言，PV 细胞的轴突分维数最高，平均为 1.45±0.02 分形单位，相比之下，NPY 细胞轴突为 1.37±0.03 分形单位，SOM 细胞的轴突分维数最低，看起来最为单向延伸（1.32±0.02 分形单位）（图 6B）。

图6. 各组间轴突分形维数的差异。(A) 各细胞组轴突及其瓦片的示例。注意瓦片中 “空白区域” 的数量各不相同。(B) 各组分形维数的平均值。(C) 各组 “轴突密度” 的平均值。该变量通过将轴突总长度除以其瓦片面积得出。采用t检验评估统计学意义；*P<0.05 ，**P<0.01。

我们推断，根据分形维数的定义，这个测量值应该与 “轴突密度” 相关，我们通过将轴突总长度除以轴突瓦片面积来计算轴突密度。事实上，这个新变量与分形维数的相关性为 67%。图 6C 显示，这个新变量保持了三组细胞之间的关系，尽管缩小了 PV 和 NPY 细胞之间的差异。因此，轴突密度可用于预测中间神经元的亚型。

08. 轴突分支

轴突分支可分为三类：初级分支产生两个末端节段，次级分支产生一个末端节段和一个再分为两个新节段的节段，三级分支产生两个节段，每个节段又各自产生两个额外的节段。每种分支类型的相对数量可被视为衡量细胞轴突不对称性的指标。次级分支越多，轴突越不对称。这个概念与科学家提出的 “分区不对称性” 类似。

在对 98 个形态学变量进行初始互相关矩阵分析后，由于 3 个分支测量变量之间的相关性超过 80%，最终只保留了其中一个。选择初级分支的百分比作为代表，因为这个变量与另外两个变量的相关性最强。

图 7A 概述了每个神经化学组中三种不同类型分支以及少量三分叉的相对数量。这三组之间最明显的区别是，SOM 细胞的次级分支最多，因此其轴突最不对称。PV 和 NPY 细胞之间的主要区别在于，NPY 细胞的三分叉比例更高。

图7. 各组间轴突分支的差异。(A) 每组初级、次级、三级分支和三分叉平均分布的图示。(B) 每个细胞按分支顺序的分支累积分布。曲线越陡峭，轴突分支按分支顺序的分布就越均匀。(C) 对于每个细胞，轴突在其第一个节点处被分成两部分。计算每组最长片段与最短片段的平均值，并在此以图形方式呈现。使用t检验评估统计学意义；*P<0.05 ，**P < 0.01。

为了进一步描述不对称性，我们研究了轴突节段按分支顺序的分布情况。我们推断，轴突节段的累积分布（按每个分支顺序的数量定义）对于更对称的细胞会显示出更陡峭的上升趋势，而对于更不对称的细胞则会显示出更平缓的上升趋势。如图 7B 所示，这种累积分布确实大致根据神经化学成分对细胞进行了聚类，并揭示出 NPY 细胞的轴突最对称，SOM 细胞的轴突最不对称。

接下来，我们在第一个分支点将每个细胞的轴突分成两部分，并测量所得片段的长度。为每种细胞类型计算两个平均值：较短片段的平均值和较长片段的平均值。对于有两个假定轴突的细胞，分别对每个轴突进行测量，然后在将数据纳入汇总组之前计算细胞平均值。图 7C 是这个测量值的图形表示，清楚地展示了上述原理：NPY 细胞的轴突最对称，而 SOM 细胞的轴突最不对称。

细胞类型之间这种差异的一种可能原因是处理过程中的人为误差。例如，投射距离较长的轴突或总长度较长的轴突可能更容易被切断。为了研究这个问题，我们分析了初级分支百分比是否与轴突总长度或轴突瓦片面积相关。我们发现，它与总长度的相关性仅为 28%，与瓦片面积呈 43% 的负相关，而与神经化学成分的相关性为 84%。

09. 轴突的绍尔分析

最后，我们计算了绍尔变量，定义为在 100μm 同心圆环内的突起长度百分比。由于轴突的绍尔测量值之间存在高度相关性，在互相关矩阵分析后，最初的 10 个变量中只保留了 3 个。因此，可以推断，通过 PCA 检测到的作为这些细胞分类重要参数的单个绍尔变量，代表了整个轴突的绍尔特征。图 8 展示了每个重建细胞以及组平均值的轴突长度随离细胞体距离的累积分布。如图 8A、B 的图形以及图 8C 的定量分析所示，在离细胞体的几个距离处，轴突梭尔特征在各组之间存在显著差异，NPY 和 SOM 细胞之间的差异最大，PV 和 NPY 细胞之间的差异最小。

图8. 各组间轴突绍尔（Sholl）长度的差异。(A) 每个细胞的轴突长度累积分布，通过测量从胞体开始的每个100μm同心圆环内轴突分支占总分支的百分比来定义。(B) 计算每个同心圆环的组平均值，然后绘制按组平均值计算的轴突长度累积分布。(C) 对组平均绍尔分析的统计结果表明，在许多同心圆环中，各组之间存在显著差异。使用t检验评估统计学意义；*P<0.05 ，**P<0.01。

四、讨论

01. 新皮层中间神经元不同类别的存在

新皮层中间神经元是否存在不同类别？一种观点认为，存在具有特定形态和电生理特征的 “短轴突” 细胞特定亚群；而另一种相反观点则强调，细胞形态可能呈连续变化，每个细胞或许都有着独特的电生理特性组合。这一问题至关重要。若新皮层中间神经元确实存在亚型，那么每种类型很可能在神经回路中发挥特定作用。因此，作为理解任何神经回路的首要步骤，明确其各个组成部分十分必要。

这场争议部分源于采用定性标准对神经元进行分类。遗憾的是，对一位研究人员而言重要且明确的标准，在另一位研究人员眼中可能显得主观随意。解决这一争议的最终办法或许是利用每个细胞自身的内在特征描述，即其转录特征或所有基因的表达模式。因此，运用单细胞聚合酶链反应、微阵列或识别转录命运规划的发育研究等技术开展系统研究，似乎是实现最终分类的理想途径。

为探究这一问题，我们对表达三种不同基因（PV、SOM 或 NPY）的三组新皮层中间神经元的形态学和电生理学变量进行了聚类分析。聚类分析过程中并不预先知晓细胞身份，但神经元仍依据其形态学和生理学参数聚为这三组。我们未对哪个变量的重要程度进行假设，而是让算法在多维空间中判断细胞能否被划分为有意义的簇。研究结果表明，所研究的三组中间神经元各自具有独特的形态学和电生理学特征组合，且这三个簇与已知细胞标记定义的中间神经元亚群相匹配，证实了该方法的有效性。我们的数据表明，新皮层中间神经元确实存在不同类别，这也与近期一项研究结果相符，该研究同样运用形态学和生理学特征聚类分析，区分了两种不同类型的新皮层中间神经元。同时，我们需提醒读者，本研究所有数据均来自幼年动物，在成熟神经回路中，这些研究的中间神经元群体之间可能会出现更多发育差异（或相似性）。此外，我们的结论仅适用于特定的皮层区域和物种，因为不同皮层区域或物种的细胞形态存在显著差异。

我们确定的这些组之间是界限分明，还是代表了形态学或电生理学变异连续空间中的峰值呢？鉴于本研究样本具有高度选择性，仅对在三种不同小鼠品系中表达 GFP 的神经元进行靶向研究，我们无法排除更广泛的样本（如对中间神经元进行大规模随机特征描述）可能会使区分度降低的可能性。然而，综合考虑我们的数据集，尤其是与每种细胞类别特有的轴突形态相关内容，更合理的假设是，每种类别都处于表型变异的一个相对狭窄子集内。

尽管本研究基于特定新皮层区域的少量神经元样本，但研究结果与对中枢神经系统其他部分神经元分化的日益完善的分子理解相符，为不同功能神经元细胞类型的存在提供了有力证据。例如，在脊髓中，不同的运动神经元、感觉神经元和中间神经元群体似乎由一种或一组特定的转录因子决定，这些转录因子的表达受神经元在前后轴和背腹轴上的坐标所决定的不同诱导分子组合调控。这些转录因子不仅决定了轴突和树突的形态特征，还决定了精确的突触连接。此外，脊髓中的轴突形态不仅可用于预测神经元身份（因其反映了神经元表达的转录因子选择），还能预测神经元功能（因其决定了神经元的靶细胞）。

02. 形态学和生理学参数之间的相关性

在定量分析中，我们揭示了电生理学和形态学参数之间的系统性关系，这些关系与神经化学成分所定义的独立参数相关。随后，我们利用相关矩阵探究哪些关键变量最适合用于界定每个细胞组。结果发现，与轴突分支相关的形态学变量，与区分不同中间神经元类别的生理学变量具有最高相关性。科学家曾前瞻性地提出，轴突形态是皮层神经元分类的最重要参数。80 多年后，我们得以用定量证据支持这一观点。

我们发现，轴突形态的多个方面与三种中间神经元类型存在不同程度的相关性。树突和轴突质心到胞体距离的差异，以及分支类型比例的差异，可能与对特定皮层亚层的不同采样和（或）支配有关。更紧凑、对称的 NPY 细胞可能在特定层或亚层微回路中发挥作用，而更不对称、分支广泛的 SOM 细胞则可能监测或影响更大范围的区域。分形维数的差异也可能对局部连接性产生影响。PV 细胞较高分形维数的轴突，可能使其能够靶向局部细胞更近端的树突，而低分形维数的 SOM 细胞可能靶向更远的细胞。即便 PV 细胞和 SOM 细胞的突触后细胞总数相同，其靶标区域也会有显著差异。最后，分支差异很有意思，因为在哺乳动物神经元中，除了不同长度或宽度的轴突会导致不同延迟外，通常认为轴突分支的确切形态并不重要。不过，在无脊椎动物中已证实，轴突的不同分支可优先响应不同频率的动作电位序列，因此在新皮层中间神经元中，不同分支模式也可能具有生理学意义。

除了形态学预测指标，本研究还指出了所研究的三种不同类型新皮层中间神经元在生理参数上的差异，我们可以对这些发现的意义进行推测。海马中的中间神经元被认为可微调皮层网络活动，将其转化为有意义的信息。因此，中间神经元精确到亚毫秒级的放电时间，可能是其在网络中发挥作用的关键因素。科学家证实，GABA 能突触在主细胞上的亚细胞位置，会对主细胞随后的放电产生不同影响，在胞体中可优化同步检测，而在树突中则允许更广泛的整合窗口。结合这一原理以及我们的发现，即靶向远端顶端树突的 SOM 细胞，比靶向胞体的 PV 细胞接收的 PSCs 动力学更慢，我们可以推断，不同类别中间神经元平均动力学的差异，为皮层提供了一种延长整体时间总和窗口的方式。

03. 输入动力学与轴突形态之间的相关性

除揭示不同中间神经元类别的特定形态学和生理学特征外，我们的研究结果还表明，中间神经元的突触后靶标与其突触输入动力学相关。这些数据与此前在海马中的类似发现一致。在这两个系统中，轴突拓扑结构与突触时间特征之间的相关性很强，因此很可能也适用于中枢神经系统的其他部分。这种有趣相关性的功能意义是什么？为什么中间神经元胞体或树突的突触输入动力学，会与其轴突形态的特定属性相关呢？

新皮层中间神经元似乎靶向锥体细胞树突的不同区域。PV 神经元主要靶向胞体或近端树突，而 SOM 细胞则倾向于与远端树突接触。关于 NPY 神经元的具体靶标了解较少，不过它们可能与神经胶质样细胞相对应，已知这类细胞靶向树突棘。因此，可能存在一种功能逻辑：具有较快突触电流动力学的中间神经元与胞体接触，而动力学较慢的则与树突或树突棘接触。这种并行通道系统似乎旨在以不同时间频率处理时间信息，这与在体内不同类别海马中间神经元在网络振荡的不同时间阶段优先被激活的发现相符。因此，每类中间神经元都具有特定的时间特性，这些特性可能在振荡或更复杂的时间模式形成中发挥重要作用。

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