《食品科学》：北京市疾病预防控制中心牛宇敏研究员、邵兵研究员等：啶虫脒在豇豆腌制过程中的生物转化

豇豆（

Vigna unguiculata

L.Walp）是世界范围内重要的经济作物，为人类提供价格低廉的植物蛋白、碳水化合物、维生素和其他营养物质。在中国，腌豇豆是一种非常受欢迎的、具有独特营养和风味的发酵蔬菜产品。豇豆在发酵过程中产生特殊的风味物质，可以增加微生物多样性并降低炎症标志物。在豇豆生长过程中，通常会使用农药消灭病虫害。由于腌制时间的变化，农药残留物及其转化产物（TPs）可能会有所不同，这会影响腌豇豆中农药残留物的风险评估。

啶虫脒是在豇豆生长过程中常用的重要农药之一。在蔬菜和水果的储存或食品生产过程中啶虫脒可能会发生降解和分解。确定啶虫脒在发酵过程中的残留降解行为非常重要。

北京市疾病预防控制中心、食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室的靳玉慎、牛宇敏*、邵兵*等使用超高效液相色谱-电喷雾离子化-串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）研究了豇豆在腌制过程中啶虫脒的降解和分解行为，并通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-QTOF-MS/MS）对其残留物和TPs进行了鉴定。基于定量构效关系（QSAR）结合计算毒理学软件ECOSAR和毒性评估软件工具T.E.S.T.进一步预测了啶虫脒及其TPs的毒性。对研究腌制过程中啶虫脒的降解转化提供了充足的数据和信息，有助于更好地了解潜在的健康风险，评估食品发酵过程中农药残留物及其TPs的环境污染程度。

1方法学评价

为了评价样品净化和仪器分析方法的性能，在确定豇豆腌制过程中的TPs之前，首先对目标化合物啶虫脒的样品回收率和方法检测限（method detection limit，MDL）进行了测定。啶虫脒UPLC-MS/MS分析的色谱图如图1a所示。为了确定方法的准确性，通过样品加标实验计算回收率，加标0.01 mg/kg和0.1 mg/kg两个水平，每个水平设置5 个重复，通过计算得到两个加标水平的回收率分别为85%～104%和88%～110%。另外为了确定啶虫脒在本研究中的MDL，在豇豆和盐水中分别加入2 μg/kg啶虫脒标准品，通过下式计算得到啶虫脒的MDL：

式中：

n

为重复测定的加标样品数；

S

n

次加标测定浓度的标准偏差；

t

为自由度为

n

-1时的Student’s

t

值（可查

t

分布表得到）；1-

a

为置信水平。

计算所得啶虫脒在豇豆和盐水中的MDL分别为1.6 μg/kg和0.8 μg/kg，与文献相比，MDL降低了一个数量级，满足检测需要。

2啶虫脒在豇豆腌制过程中的降解消散行为

为评估啶虫脒的降解消散行为，使用UPLC-MS/MS分析测定不同时间段的豇豆和盐水中啶虫脒的残留量（图1b、c）。啶虫脒（包括豇豆和盐水）的总降解曲线如图1b所示，表明在豇豆腌制过程中啶虫脒的降解过程遵循一级动力学模型，其降解动力学方程为 Ct ＝0.96761e -0.01911

t

，其

R

2 为0.9309，半衰期为（34.95±0.78）d，降解速率常数为0.96761。对照组（只加盐，不加乳酸菌）在初始阶段啶虫脒基本不发生降解，直到第7天才开始发生降解（图1c），且降解速度逐步增加，这可能是由于自然发酵过程中，在初始阶段发酵罐内乳酸菌数量过低后续随着时间的延长乳酸菌数量逐步增加 。上述结果表明无论在加入乳酸菌的发酵过程中还是不加乳酸菌的发酵过程中，啶虫脒均会发生降解，只是降解速率有所不同，因此在泡菜发酵过程中可以尝试通过预先加入乳酸菌的方式加速啶虫脒的降解，从而降低其在食品中的残留量。

3啶虫脒在豇豆腌制过程中的降解产物的鉴定

为了揭示啶虫脒在豇豆腌制过程中降解产物的化学结构，深入研究了啶虫脒的MS/MS谱，其产生的主要离子片段有

m

z

126、99、90、63、56和51（图2a）。推测其裂解途径如图2b所示，在

m

z

126处的主要碎片（[C 6 H 5 ClN] + ）由前体离子直接破碎产生。随后HCN的丢失得到了二级离子

m

z

99（[C 5 H 4 Cl] + ），此外，一些片段显示了氯化物常见的中性损失特征，如

m

z

126消除HCl后生成了

m

z

90（[C 6 H 4 N] + ）。

m

z

99进一步裂解消除HCl后生成

m

z

63（[C 5 H 3 ] + ）。

m

z

56和

m

z

51处的片段可能源于消除反应。

在豇豆腌制过程中，使用Xevo G2-XS QTOF系统对发酵过程中啶虫脒的TPs进行鉴定。啶虫脒的TPs的筛查需满足以下两个条件：1）至少具有一个与啶虫脒相同的子离子；2）分子离子峰强度不小于104。通过MS-DIAL（版本4.70）和MS-FINDER（版本3.52）对可能的TPs进行分析，与对照组（不加啶虫脒）相比，在负离子模式下未发现符合条件的差异代谢物，在正离子模式下发现4 种差异代谢物，对照组和腌制豇豆组的总离子流图如图3所示，共发现了4 种TPs。根据TPs出现的时间和峰值变化，推测啶虫脒在豇豆腌制过程中的代谢途径如图4所示，TPs的结构通过收集其MS/MS碎片片段进行确证（图5）。

TP1（C9H9ClN4，

m

z

209）为啶虫脒的去甲基化衍生物 ，其母离子为

m

z

209，碎片离子

m

z

99、90、63分别对应质子化离子[C 5 H 4 Cl] + 、[C 6 H 4 N] + 、[C 5 H 3 ] + ，与母体化合物的质子化离子相对应（图5a）；TP2（C 9 H 9 ClN 4 O，

m

z

225）呈现出3 个碎片：第一个片段对应于119 Da（—C 3 H 5 N 3 Cl）的损失，可能是由于前体分子中

N

-氰-

N

-甲基部分的损失和脱氯引起的，另外两个碎片离子分别为

m

z

78（[C 5 H 4 N] + ）和

m

z

51（[C 4 H 3 ] + ），分别是由第一个片段发生典型的中性缺失（—CO和—HCN）引起的（图5b）；TP3（C 8 H 9 ClN 2 O，

m

z

185）在MS/MS谱上有4 个片段：

m

z

126是由于—C 2 H 4 NO的损失得到的，此外

m

z

107（[C 6 H 7 N 2 ] + ）片段与—C 2 H 2 OCl的损失有关，该离子进一步损失—NH 3 基团（17 Da）得到

m

z

90（[C 6 H 4 N] + ）或损失—CH 3 N基团（29 Da）得到

m

z

78（[C 5 H 4 N] + ）（图5c）；TP4（C 6 H 10 N 2 O 2 ，

m

z

143）在MS/MS图谱显示出3 个碎片片段：

m

z

125（[C 6 H 9 N 2 O] + ）由H 2 O（18 Da）的损失得到，进一步损失—CO（28 Da）得到碎片离子

m

z

97（[C 5 H 9 N 2 ] + ），进一步失去—HCN（27 Da）和—CH 2 （14 Da）得到第3个碎片离子

m

z

56（[C 3 H 6 N] + ）（图5d）。根据推测的TPs结果，啶虫脒在豇豆腌制过程中经历了去甲基化、羟基化、水解、加氢等过程得到了这些产物（表1）。

通过文献调研发现国内外鲜见乳酸菌代谢啶虫脒的报道，仅刘鹏等报道了乳酸菌可以降低啶虫脒对蜜蜂的毒害作用，并且鲜有研究乳酸菌是否导致啶虫脒的降解，但是确实很多种农药（如多菌灵、多效唑、马拉硫磷等）在蔬菜腌制或发酵过程中发生明显的降解，但是并未证实发挥主要作用的因素。在我国腌制菜的自然发酵过程中，从第2周开始，乳酸菌开始从0%增加到59.43%，并在之后的28 d内占主导地位（＞99.0%）。此外，研究表明盐质量分数（1.72%～4.42%）是决定细胞组成的主要因素，乳酸菌在高盐浓度下生长良好。本研究中，在豇豆腌制的初始阶段添加乳酸菌，且本研究中盐质量分数为4%非常适合乳酸菌的生长，因此在整个发酵过程中乳酸菌一直占主导地位，推测腌制过程中啶虫脒的代谢主要由乳酸菌引起。

4啶虫脒及其TPs的生态毒性评估

本研究采用ECOSAR软件对啶虫脒的降解产物进行了毒性预测和分析。从表2可以看出，鱼类在啶虫脒溶液96 h后的LC50为59.047 mg/L，具有较强的毒性，然而在豇豆腌制过程中在微生物的作用下，其降解产物的毒性相较于啶虫脒本身明显下降，尤其是产物TP4的LC50为128000 mg/L，达到了无害水平。同时水蚤的LC50和绿藻的EC50也随着降解的逐步进行显著降低，表明啶虫脒的降解产物对水生生物的急性毒性影响可以忽略不计。从慢性毒性预测数据中可以看出，降解产物的慢性毒性较啶虫脒母体普遍降低，仅有TP2对水蚤的慢性毒性为80.743 mg/L，达到了较强毒性水平，这表明啶虫脒的降解产物TP2可能对水蚤等水生生物产生长期潜在的慢性毒性影响，这提示研究者在评估物质的生态毒性时，要综合考虑其急性毒性和慢性毒性的影响。

为了进一步评估啶虫脒及其TP的大鼠口服致死剂量（LD50）、发育毒性和致突变性，本研究用T.E.S.T.软件和QSAR分析进行了毒性预测和分析（表3）。研究显示啶虫脒的LD50实验值为217.00 mg/kg，根据联合国出台的全球化学品统一分类和标签制度的急性毒性，划分标准属于第四类“有害”等级；降解产物TP1（358.17 mg/kg）和TP2（385.7 mg/kg）的LD50稍高于母体，说明含有啶虫脒的豇豆在腌制过程中即使发生降解仍存在大鼠口服毒性；此外在豇豆的腌制过程中，随着啶虫脒降解的进展，降解产物TP1和TP2的发育毒性明显增加，远高于啶虫脒，可能对个体生长发育产生影响，因此需要特别关注这些降解产物的长期影响；所有产物的致突变性均小于母体，并且除了TP2为阳性以外，其余物质均为阴性，提示大部分转化产物不存在致突变性。这些结果表明，在豇豆腌制的过程中啶虫脒发生有效降解，尽管多数降解产物毒性降低，但仍有部分降解产物可能比啶虫脒具有更高的生物毒性，因此，应重视啶虫脒在豇豆腌制过程中的生物毒性，建议毒理学专家们进一步研究啶虫脒及其降解产物的长期生态影响和导致发育毒性的机制，以便更全面地评估其健康风险。

5实际样品中啶虫脒及其TPs分析

为了研究市售腌制豇豆中啶虫脒的残留和转化情况，对来自不同厂家的腌制豇豆样品中的啶虫脒及其4 种TPs分别进行了定量和定性分析，每个样品分析了3 次。图6显示了样品中啶虫脒的平均质量浓度，结果显示在购买的35 个样品中啶虫脒均有检出，最高质量浓度为473.8 μg/L，中位质量浓度为41.1 μg/L。分别有17.1%、37.1%和31.4%的样品超过了中国食豆类蔬菜中啶虫脒的MRL值（400 μg/L，GB 2763—2021《食品中农药最大残留限量》）和美国（100 μg/L）以及大多数欧盟国家（150 μg/L），表明市售的腌制豇豆可能对人类健康有害。考虑到啶虫脒的长期摄入可能会对肝脏、肾脏等器官产生损害，并可能导致其他健康问题，因此实际样品中啶虫脒的残留情况提示要关注食品中农药残留问题，加强食品安全监管，以保护人民群众的健康和安全。

进一步检测了所购买的腌制豇豆样品中是否存在上面所提到的TPs，结果表明，在购买的腌制豇豆样品中，TP1、TP2和TP3几乎存在于所有的样品中（表4），其离子提取色谱图如图7所示，在所有样品中TP4均未检出，这可能是由于市场上可获得的腌制豇豆样品的发酵周期较短或TP4响应较低。前面的毒性评估试验显示TP1和TP2的LD50均小于母体且发育毒性较母体明显增加。因此，市售腌制豇豆的安全问题值得关注。

结 论

本研究通过UPLC-QTOF-MS/MS预测了啶虫脒在豇豆腌制过程中的消散与转化行为。结果表明，啶虫脒在豇豆腌制过程中通过多种机制（如羟基化、水解、脱甲基化、加氢等反应）产生了4 个主要的TPs。初步的毒性评价结果表明，部分转化产物具有更低的大鼠致死剂量以及更高的发育毒性，存在潜在的毒性风险。因此，尽管啶虫脒在豇豆腌制过程中会发生一定程度的降解消散，但仍需要关注其TPs的生物毒性，发酵食品的安全问题值得重视。

作者简介

通信作者：

邵兵，研究员，博导，北京市疾病预防控制中心首席专家，健康中国行动推进计划专家咨询委员会委员、国家食品安全标准分析方法标准委员会副主任委员、国家食品安全风险评估专家委员会委员、科技部“十一五”、“十二五”“十三五”食品安全专项、“十三五”科技冬奥专项、“十四五”营养与食品安全专项总体咨询专家组成员。入选国家“万人计划”科技创新领军人才、科技部“中青年科技创新”领军人才、北京市战略科技人才等。主持国家科技支撑计划、“十三五”国家重点研发计划（综合绩效评价优秀）、国家自然科学基金重点等项目20余项，以第一和通信作者发表Chemical Engineering Journal、Annual Review of Food Science and Technology、Analytical Chemistry、Environmental Science & Technology等高水平论文170余篇，2020-2022连续3年入选“Elsevier”中国高被引学者，获授权国家发明专利16件，国际专利1件，牵头制定国家标准5项。围绕我国食品安全风险监测和标准制修订需求，开展了食品中壬基酚、五氯苯酚、双酚A及其替代物等新污染物的精准检测、暴露评估和风险表征。开展了食品中化学危害因子的非靶向筛查技术研究，制备了一系列性能优异的样品前处理材料，实现了食品中化学危害因子的高效回收；攻克了现有筛查软件无法容纳多源大容量质谱数据和比对搜索速度慢等瓶颈问题，构建了异源质谱数据的统一处理平台和多维数据库，实现了食品中化学危害物检测从定向向非定向筛查，在多起食品安全事件中发挥了重要的技术支撑。

通信作者：

牛宇敏，研究员，北京市疾病预防控制中心，中心实验室，副主任。

学习经历：

2012.09–2015.07 博士，中国科学院生态环境研究中心，分析化学专业，导师：刘景富

2009.09–2012.07 硕士，首都医科大学，营养与食品卫生专业，导师：邵兵

2005.09–2010.07 学士，中国药科大学，食品质量与安全专业

工作经历：

2024.01-至今 北京市疾病预防控制中心 中心实验室 副主任

2023.11-至今 北京市疾病预防控制中心 中心实验室 研究员

2023.01-至今 首都医科大学副教授，硕士研究生导师，北京市科委食品安全专家库成员

2019.11-至今 北京市疾病预防控制中心 中心实验室 副研究员

2015.08-2019.11 北京市疾病预防控制中心 中心实验室 助理研究员

研究方向：

化学危害物精准识别技术及健康风险研究

学术成果：

作为负责人主持国家自然科学基金等国家级和省部级等科研课题9 项。 以第一/通信作者发表论文30余篇，其中在 TRAC-Trends in Anal Chem、Food Chem、Environ Sci. Technol 等食品和环境化学SCI核心期刊发表论文15 篇。

第一作者：

靳玉慎，副研究员，北京市疾病预防控制中心，中心实验室，科员。

学习及工作经历

2021/11-至今 北京市疾病预防控制中心 副研究员

2019/06-2021/11 北京市疾病预防控制中心 助理研究员

2016/07-2019/05 中国科学院自动化研究所 助理研究员

2012/09–2016/04 哈尔滨工业大学生命科学与技术学院 生物医学工程 （博士）

2010/07–2012/07 哈尔滨工业大学生命科学与技术学院 生物医学工程（工学硕士）

2006/08–2010/07 哈尔滨工业大学理学院生命科学与工程系 生物技术（理学学士）

研究方向：

1. 食品储存加工过程中农兽药残留及降解；

2. 食品化学危害因子非定向筛查样品前处理及全回收技术研究；

3. 定向高效的富集净化及降解技术研发；

4. 纳米材料的设计、合成及其生物应用；

5. 靶向药物载体的制备及缓释研究；

6. 诊疗一体化探针的研发和生物应用

学术任职：

担任Chemical Engineering Journal，Bioconjugate Chemistry, Contrast Media & Molecular Imaging等杂志的审稿人

本文《啶虫脒在豇豆腌制过程中的生物转化》来源于《食品科学》2024年45卷14期240-248页。作者：靳玉慎，唐初，李会，邢杨，范梦蝶，牛宇敏，邵兵。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231123-175。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：陈丽先；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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