《食品科学》：湖南农业大学沈清武教授等：牛肉宰后冷却贮藏期肉色稳定性的变化及其机制

肉类产品在流通、销售和贮藏等各个环节中，容易受到各种外界条件和内在因素的影响发生改变。在宰后的肌肉贮藏中，肌红蛋白（Mb）是主要的色素物质，对肉的色泽起决定作用。研究已经证实高铁肌红蛋白（MetMb）作为Mb在肌肉中的主要存在形式，在特定条件下可转化为脱氧肌红蛋白（DeoMb）和氧合肌红蛋白（OxyMb），直接影响肉色特征与稳定性。 蛋白质组学是通过高度灵敏、高通量分析设备结合化学计量学、生物信息学等技术，深入研究蛋白质的组成、结构、功能和相互作用的一种新兴手段。目前，蛋白质组学技术在肉品科学领域的研究中也得到了广泛的应用。

湖南农业大学食品科学技术学院的吕锦涛、舒一梅和沈清武*等 拟采用定量蛋白质组学的方法对4 ℃条件下不同贮藏时间点的牛背最长肌进行研究，从蛋白质层面揭示影响Mb氧化导致肉色劣变的分子机制。以期为提高贮藏期肉色的稳定性、提升肉类贮藏过程的品质提供理论基础。

1 不同处理组的肉色分析

R630/580可以用来表示鲜肉在存放过程中肉色的变化，是肉色稳定性的间接指标，其值越大表明肉色稳定性越高，将第8天的牛肉样品R630/580作为区分肉色稳定性组的依据。将40个牛肌肉样品按照贮藏第8天时的R630/580的大小排序，从高到低依次编号1到40。随后按照a*值的大小排序，分别从1到20号中选择出a*值最高的6个牛肌肉样品、从21到40号中选择a*值最低的6个牛肌肉样品分别作为高肉色稳定组（n＝6）和低肉色稳定组（n＝6）的样品。

如表1所示，L*值在整个贮藏期内相对稳定，未发生显著改变。b*值表示黄度值，b*值越高则肉颜色越趋近于黄色，相反则肉色趋近于蓝色。高、低肉色稳定组的b*值均为先升高后降低，但高肉色稳定组的b*值在贮藏期的3个时间段均显著高于低肉色稳定组。

如表1、2所示，40头牛肉样品的初始a*值除个别样品外，其余无显著差异。a*值随着时间的延长呈现先上升后降低的趋势。而高、低肉色稳定组在不同贮藏时间的a*值均存在显著差异，尤其是在贮藏第8天时，高肉色稳定性组的a*值显著高于低肉色稳定性组。此外，肉在贮藏过程中pH值的变化可能会影响与肉色有关酶的活性，特别是与高铁肌红蛋白酶相关的电子传递链，进而影响肉色的稳定性。同时，pH值的变化也与蛋白质降解程度及微生物生命活动代谢物积累程度有关，这也是影响肉色稳定性的重要因素。如表1所示，不同牛肉样品在75 min的pH值为6.51～6.59，背肌的pH值均随着贮藏期的延长呈下降趋势，最后稳定维持在5.4左右。

样品组间相关性分析如图1所示。牛肉样品在不同肉色组及贮藏期间能够很好地区分，该结果进一步充分证明了本研究中样品采集以及高、低肉色稳定性组设置的合理性，蛋白质组学数据真实可靠，具有一定代表性，能够满足后续分析要求。

2 蛋白鉴定与差异蛋白的筛选

以倍数变化（FC）＞1.5或＜1/1.5且P＜0.05为标准筛选出差异蛋白，结果如图2所示。高、低肉色稳定性组中共鉴定到1 377种蛋白质。其中，在宰后75 min时，低、高肉色稳定组分别鉴定到了1 229、1 306种蛋白；在宰后2 d时，低、高肉色组分别鉴定到了1 235、1 347种蛋白；在宰后8 d时，低、高肉色稳定组分别鉴定到了1 204、1 236种蛋白（图2B）。

如图2C所示，3个贮藏期高、低肉色稳定组中鉴定出了136种差异蛋白质。其中，在 宰后75 min时，高、低肉色稳定组的差异蛋白有27个为上调，22个下调。在宰后2 d时，高、低肉色稳定组的差异蛋白有13个为上调，23个下调。在宰后8 d时，高、低肉色稳定组的差异蛋白有22个为上调，29个下调。在贮藏期，差异蛋白数量呈现先下降再上升的趋势，可能受宰后早期能量代谢和氧化还原的影响。

宰后2 d，高、低肉色组鉴定出的差异蛋白中主要为代谢酶类，如丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、甘油酸脱氢酶、磷酸葡萄糖变位酶、己糖激酶等，其中己糖激酶是糖酵解的关键限速酶。丙酮酸脱氢酶参与糖酵解过程，催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A和NADH，生成的NADH可以参与MetMb的还原，有助于维持肉色及其稳定性。有研究发现在添加了特定的底物后，NADH可以通过在宰后肌肉细胞质中的乳酸脱氢酶（LDH）或线粒体中的LDH再生，说明NADH的宰后再生对于延缓肉色劣变至关重 要。另外，有研究表明在分离出的牛心肌线粒体中，添加乳酸盐、LDH和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）后产生NADH，NADH可以进入复合物I（NADH脱氢酶）并导致电子传递链中的电子运动。

宰后8 d，高、低肉色组鉴定到的差异蛋白主要有NADH脱氢酶(泛醌)1α亚复合体7（NDUFA7）、NADH脱氢酶(泛醌)1β亚复合体8（NDUFB8）、NADH脱氢酶(泛醌)1（NDUFS1）等，在差异表达中为上调，它们主要参与了电子呼吸链的氧还原过程，但差异蛋白相比与宰后早期，能量代谢相关的酶急剧减少，这可能与细胞凋亡导致无法进行能量代谢有关。

3 差异蛋白的基因本体论分析

将高低肉色稳定性组在不同贮藏时间点的差异化蛋白进行GO功能注释及富集分析，其中GO富集分析结果如图3所示。宰后75 min，根据所涉及的生物过程，差异蛋白主要参与细胞过程（41种）、生物调控（21种）和代谢过程（30种）（图3A）。根据细胞组分，牛肌肉高、低肉色稳定组中的大多数差异蛋白质是细胞质蛋白，其细胞亚定位显示细胞质蛋白（22种），其次是线粒体蛋白（14种）（图3B）。根据分子功能，鉴定到的差异蛋白中26种是具有催化活性的蛋白，25种是具有结合作用的蛋白（图3C）。

如图4A所示，根据生物过程，贮藏2 d后，高、低肉色稳定性组中差异蛋白主要参与细胞过程（41种）、生物调控（21种）和代谢过程（30种）（图3A）。根据 细 胞组分，牛肌肉高、低肉色稳定组中的大多数差异蛋白质是细胞质蛋白，其细胞亚定位显示细胞质蛋白（22种），其次是线粒体蛋白（14种）（图3B）。根据分子功能，鉴定到的差异蛋白中26种是具有催化活性的蛋白，25种是具有结合作用的蛋白（图3C）。

如图5A所示，根据生物过程，贮藏8 d后，高、低肉色稳定性组中差异蛋白主要参与细胞过程（26种）、生物调控（21种）和代谢过程（21种）。根据细胞组分，高、低肉色组中的大 多数差异蛋白质是细胞质蛋白（16种），其次是细胞核蛋白（11种）（图5B）。根据分子功能，鉴定到的差异蛋白主要是具有结合作用的蛋白（18种）、催化活性的酶（14种）（图5C）。

4 差异蛋白的京都基因与基因组百科全书通路富集分析

本研究进一步利用KEGG数据库对FC大于1.5的差异蛋白进行通路注释分析，明确其可能参与的代谢过程或信号通路。在3个贮藏时间段，高、低肉色稳定组差异蛋白主要富集到了53条通路。如图6A所示，在贮藏75 min时，高、低肉色稳定性组的差异蛋白主要参与了氧化磷酸化。在宰后2 d（图6B），差异蛋白主要参与了胰岛素信号通路等。在宰后8 d（图6C），差异蛋白主要参与了胰岛素信号通路。在这3个贮藏时间段，差异蛋白参与的KEGG通路的富集分析表明，差异蛋白可能通过呼吸电子传递链、信号转导等途径参与肌肉肉色稳定性的调控。

5 乙酰化蛋白的互作网络

为了更好地理解蛋白质参与宰后肉色稳定性的调控，将高、低肉色组肌肉中鉴定到的差异蛋白列表展示（表3）并提交到高置信度评分（得分≥0.7）的STRING软件进行蛋白质-蛋白质相互作用分析。

高、低肉色组差异蛋白在75 min、2 d、8 d 3个贮藏期的蛋白互作如图7所示。在宰后75 min，氧化还原及其相关蛋白是高、低肉色组差异蛋白质组中联系最密切的，这可能与宰后早期肌肉线粒体内活跃的能量代谢有关。

在宰后2 d，高、低肉色稳定组的差异蛋白数量减少，且主要为代谢相关的酶类。本研究中发现，在高、低肉色组的差异蛋白中，GLUD1、LDHB、TXNRD1表达量上调，这些酶的表达促进了MetMb的还原，且高表达的GLUD1、LDH B、TXNRD1很可能通过促进三羧酸循环等过程参与了肉色稳定性的调控。以上代谢酶均是参与三羧酸循环、糖代谢等代谢循环的重要酶类，通过影响NADH的生成并进一步影响宰后肉中MetMb的还原。在宰后8 d，高、低肉色组差异蛋白之间的关联减少，主要为氧化还原相关的NDUFB8、NDUFS2、NDUFA7形成了密切的关联，代谢酶减少，这可能与贮藏后期细胞凋亡而导致的能量代谢终止有关。因此，通过不同贮藏期的差异蛋白互作分析，表明呼吸电子传递链、能量代谢等过程参与了肉色稳定性的调控。

讨 论

电子传递链存在于线粒体内膜，包括多种脱氢酶、氢和电子传递体。电子传递链可通过传递电子使琥珀酸脱氢酶的辅基NADH将电子传递给MetMb，促使MetMb还原。同时，MetMb的还原过程中，电子传递链的完整性非常关键。近年来也有研究指出在MetMb的还原过程中，电子传递链的反向电子转移也可以维持MetMb的还原。这都说明了无论是从正向进行电子传递还是反向进行电子传递都对MetMb的还原程度有不同程度影响。NAUFA4是细胞色素c氧化酶的一个副亚基，其在NADH与电子传递链之间的电子传输中扮演着重要的角色，它能维持和加速机体的氧化反应，并最终促进ATP的合成，从而保持机体的正常活性。NDUFB3是线粒体膜电子传递链NADH脱氢酶I的副亚基，参与线粒体内膜上的呼吸作用，同时调节NADH脱氢酶活性。此外，宰后的肌肉是有活性的，且其能通过呼吸电子链还原MetMb，使得肉色恢复。其中，参与MetMb还原的电子来自NADH或线粒体介导的电子转移。

本研究中，电子传递链相关蛋白NDUFA 4、NDUFB8、NDUFA9、NDUFB3等在75 min、2 d、8 d 3 个时间段均为上调，表明这些与呼吸电子传递链相关的蛋白促进了MetMb的还原，提高了肉色。另外，线粒体合成酶（ATP5MG）是线粒体ATP合酶F1亚单位的一个组成部分，是线粒体内的一个关键酶，它在细胞内产生ATP。ATP5MG和ATP合酶参与了细胞内的能量代谢过程。同时，本研究中的ATP5MG、线粒体外膜转运蛋白（MTX2）、线粒体ATP合成酶亚基（ATP5MF）在3 个时间段中均呈上调，也说明高肉色组的肌肉细胞内能量代谢、氧化还原反应等代谢的进行更活跃，从而使得高肉色组的肉色稳定性更好。因此，这表明氧化还原过程相关的酶可能通过呼吸电子传递链调控了肉色稳定性。

同时，本研究中，在高、低肉色组的3 个贮藏时间分别鉴定到了热休克蛋白3（HSPB3）、热休克蛋白7（HSPB7）、热休克60 kDa蛋白1（HSPD1）3 种差异蛋白，均为上调。热休克蛋白β-8（HSPB8）是一种在缺血缺氧条件下表达量上调的应激蛋白，防止细胞受到氧化或凋亡损伤。HSPB8过表达后会增加线粒体产生NO的能力，而NO可以减少宰后线粒体的氧气消耗和ROS的产生从而为应激的细胞提供保护，因此通常将HSPB8作为缺血缺氧后保护线粒体功能的潜在指标。HSPB3、HSPB7、HSPD1表达量的上调，反映了高肉色稳定组在宰后初期肌细胞对抗氧化应激所产生的自我防御能力更强。

结 论

本研究基于蛋白质组学技术，在3个贮藏期高、低肉色稳定组中鉴定出了136种差异蛋白质，通过GO分析、KEGG通路富集分析、蛋白互作网络分析，发现不同贮藏时间的高、低肉色组的差异蛋白主要富集在呼吸电子传递链、能量代谢等生物过程。通过Uniprot数据库对鉴定出的差异蛋白进行逐一搜索，筛选出4种与呼吸 电子传递链相关的差异蛋白，分别为UQCR10、COX7A1、ATP5M G、ATP5MF，这些蛋白质主要通过能量代谢过程和氧化还原过程影响氧化还原酶活性，进而影响了肉色的稳定性。然而，目前针对肉色稳定性调控的分子机制研究仍不够清楚，在未来对这4种差异蛋白深入探究，开展分子层面的与肉色变化的关系研究，为预防肉色劣变提供理论基础。

本文《牛肉宰后冷却贮藏期肉色稳定性的变化及其机制》来源于《食品科学》2024年45卷第14期208-216页，作者：吕锦涛, 舒一梅, 全威, 沈清武。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230922-207。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：俞逸岚 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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